目前，鼠传人类疾病有57种，其中病毒性疾病有31种、细菌性疾病14种、立克次体病5种、寄生虫病7种^[1]。随着国际交往日益频繁，鼠传疾病和鼠类的传入传出日趋严重，各检验检疫系统均采取了积极措施，但广西壮族自治区（广西）口岸关于鼠传疾病病原体的研究报道甚少。本研究通过对广西部分主要陆路、内河、海港、空港口岸的鼠传疾病病原体进行研究，为口岸鼠传疾病的预防和控制提供参考依据。

分别于2014年6月在平孟口岸（陆路）、2014年5－7月在东兴口岸（陆路），2015年2－ 4月在石头埠口岸（海港）、北海港口岸（海港）、贵港口岸（内河）和梧州港口岸（内河），2014年11月至2015年4月在钦州港口岸（海港）、2014年11月至2015年1月在南宁市吴圩机场（空港）开展调查。以口岸及周边400 m内区域为调查范围。每个监测点每月连续工具捕鼠3 d，晚放晨收。将捕获的小兽装于鼠袋内，带回实验室检查其体表寄生物并进行分类鉴定。无菌解剖，取小兽肺、肝、肾组织置于细胞冻存管内，保存于-40 ℃冰箱，待检。

将小兽脏器标本从冰箱中取出，置于冰上，在二级生物安全柜内将体质量约25 mg的小兽肺、肝、肾分别置于2 ml平底离心管内（含3个ϕ 1 mm研磨珠），加入1 ml DMEM High Glucose培养液，用高通量组织破碎仪（Tissuelyser，Qiagen，德国）以29.5次/s、振荡6 min进行研磨，使组织成匀浆。

从小兽肺研磨上清液中提取总RNA，按QIAamp MinElute Virus Spin Kit操作说明书立即提取RNA；按Promega Reverse Transcription System A3500试剂盒说明书反转录为cDNA。

分别从小兽肝、肾研磨悬浊液中提取DNA，按TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒说明书操作。

分别以cDNA和DNA为模板，利用巢式PCR方法检测小兽肺中的汉坦病毒核酸^[2]、小兽肝中的立克次体^[3]，用PCR方法检测小兽肝中的伯氏疏螺旋体^[4]、巴尔通体^[5]及小兽肾中的钩端螺旋体（钩体）核酸^[6]。反应体系25 μl：cDNA（或DNA）2 μl，2×Taq MasterMix 12.5 μl，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μl，水9.5 μl，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，于紫外灯下观察结果，PCR阳性产物送北京六合华大基因科技有限公司测序。

利用Mega 6.0软件构建系统进化树，分析采用1 000个多序列组。用于比较分析的汉坦病毒序列来自于GenBank。

在广西地区8个口岸共布放鼠笼7 500个，有效鼠夹7 500夹次，捕获小兽86只，平均密度为1.15%。其中褐家鼠（Rattus norvegicus）数量最多，占捕获总数的67.4%（58/86），其次为黄胸鼠（R. tanezumi）和臭鼩鼱（Suncus murinus），分别占捕获总数的22.1%（19/86）和10.5%（9/86）。

对86份小兽脏器标本进行汉坦病毒、立克次体、伯氏疏螺旋体和巴尔通体的核酸检测，对南宁市吴圩机场17份小兽肾标本进行钩体核酸检测。其中伯氏疏螺旋体和立克次体均未扩增到目的条带。

用汉坦病毒引物检测86份小兽肺cDNA，3份小兽肺扩增到分子质量约380 bp的条带，与目的片段大小一致，利用Lasergene软件对编码RNA聚合酶开放阅读框（ORF）进行基因序列比对及核苷酸推导的氨基酸同源性分析发现，3份样本核苷酸序列的同源性为92.3%~99.5%，其编码RNA聚合酶的氨基酸同源性为98.6%~100%。

利用Mega 6.0软件构建系统进化树，GXBHGS201502160001、GXGGS201503260001和GXGGS201503260002与汉城型汉坦病毒（SEOV）的CGRn8316及CGRn9415株亲缘关系最远；GXBHGS201502160001与2013-243及2010-97株的亲缘关系最近，GXGGS201503260001和GXGGS201503260002与Seoul 80-39亲缘关系最近，见图 1。

图 1 小兽样本中汉坦病毒片段核苷酸序列构建的系统进化树 Figure 1 Phylogenetic tree of Hantavirus fragment gene in rodent samples

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利用巴尔通体引物检测86份小兽肝DNA，其中有2份小兽肝扩增到约380 bp的条带，与目的片段大小一致。利用Lasergene软件对ORF进行基因序列比对及核苷酸推导的氨基酸同源性分析发现，2份样本核苷酸序列的同源性为91.2%，氨基酸同源性为68.2%。

由系统进化树（图 2）可以看出，GXNJ201411190032与T108LN株的亲缘关系最远，与B28170株的亲缘关系最近。GXGGS201504230001与THSKR-008亲缘关系最远，与SM111HAIN亲缘关系最近。

图 2 小兽样本中巴尔通体核苷酸序列构建的系统发育树 Figure 2 Phylogenetic tree of Bartonella fragment gene in rodent samples

图选项

利用钩体引物检测南宁市吴圩机场17份小兽肾DNA，2014年11、12月和2015年1月分别有3、1和2份标本扩增到约480 bp的条带，与目的片段大小一致。利用Lasergene软件对ORF进行基因序列比对及核苷酸推导的氨基酸同源性分析发现，6份样本核苷酸序列的同源性为98.6%~100%，氨基酸同源性为96.6%~100%。

由系统发育树（图 3）可以看出，GXNJ201411190026、GXNJ201501210043、GXNJ201411190027、GXNJ201411190034、GXNJ2014170037和GXNJ201501200041与sp. clone 234的亲缘关系最近，与BMLepto4株的亲缘关系最远。

图 3 小兽样本中钩体核苷酸构建的系统进化树 Figure 3 Phylogenetic tree of Leptospira fragment gene in rodent samples

图选项

汉坦病毒核酸总阳性率为3.5%（3/86），均来源于褐家鼠；巴尔通体总阳性率为2.3%（2/86），褐家鼠和黄胸鼠阳性率分别为1.7%（1/58）和5.3%（1/19）；南宁市吴圩机场共检测17份小兽样本，钩体总阳性率为35.3%（6/17）。其中9份黄胸鼠样本和8份褐家鼠样本中均检出钩体核酸阳性3份。

汉坦病毒可导致汉坦病毒性肺综合征（HPS）和肾综合征出血热（HFRS），分布于亚洲、欧洲、非洲、美洲、大洋洲的70多个国家，流行广、危害重，已成为全球性公共卫生问题^[7]。本研究检测出汉坦病毒核酸阳性样本3份，均来源于褐家鼠，其阳性率（5.2%）高于以往广西地区的监测水平^[8]，可能与本次在春季采样有关。广西属于家鼠型HFRS疫区，鼠疫高发季节在春季，而携带汉坦病毒的鼠总数与季节发病率成正比^[9]。

人类可能因偶然接触自然环境中的啮齿类等野生动物而感染巴尔通体或致病。20世纪90年代后，各种巴尔通体引起的心内膜炎、菌血症等病例逐渐增多，引起临床医师和微生物学家的关注^[10]。本研究从褐家鼠和黄胸鼠体内均检出巴尔通体核酸阳性，证实该地小兽可能存在巴尔通体感染。

钩体病是由致病性钩体引起的急性传染病，鼠类和猪是主要传染源，呈全球性分布，以热带和亚热带地区最为常见^[7]，广西每年均有病例发生^[11]。本次调查南宁市吴圩机场小兽的核酸阳性率较高（6/17），略高于2009－2011年广西3个钩体病监测点（容县、宾阳县、金秀县）的平均阳性率（28%）^[11]，可能与本次用PCR法检测有关，以往采用组织培养法分离钩体，而PCR法灵敏度远高于组织培养法^[12]。

广西已经证实存在莱姆病和立克次体病疫源地^[13]。本次调查虽未检测到立克次体和伯氏疏螺旋体，但不排除广西口岸鼠类自然感染该病原体，仍需对该地区的小兽进行监测，以采取有效的防控措施。

本次调查地点为口岸区域，于口岸及周围400 m范围内捕获小兽。鼠传疾病可通过多种途径传播，随着人类频繁活动、国际贸易频繁及快捷的交通，鼠类活动范围和扩散速度不断增加，导致口岸鼠传疾病具有复杂性和多样性，也给口岸鼠传疾病的控制带来困难^[7]。因此，应采取物理、生物及化学等综合防治措施控制鼠密度，并加强口岸小兽类的监测及相关病原体的检测，保障居民健康，构建安全卫生检疫屏障。