硬蜱（科）分布广泛，可侵袭除鱼类外的几乎所有脊椎动物，并传播多种病原体，是威胁人类健康的重要病媒生物^[1]。巴贝西虫属（Babesia）原虫超过100种，部分巴贝西虫可感染人类。巴贝西虫寄生于脊椎动物红细胞内，是一种常见的蜱传寄生虫。近年来，我国报道的人感染巴贝西虫病例数明显增加^[2]，因此，巴贝西虫病被认为是我国的一种新发威胁^[2-3]。田鼠巴贝西虫（Babesia microti）可感染人类，自然界中其主要宿主是鼠类，主要传播媒介是硬蜱属，其他属少数蜱种亦有检出^[4-5]。我国东北地区的田鼠巴贝西虫主要传播媒介是全沟硬蜱（Ixodes persuleatus），嗜群血蜱（Haemaphysalis concinna）亦有感染^[6-7]。我国南方地区广泛分布的镰形扇头蜱（Rhipicephalus haemaphysaloides）亦可传播田鼠巴贝西虫^[8]。

日本血蜱（H. japonica）是三宿主蜱，在我国广泛分布^[9]，其侵袭力强^[10]，能传播立克次体^[11]、伯氏疏螺旋体^[12]和森林脑炎病毒^[13]等多种病原体。但关于日本血蜱对田鼠巴贝西虫传播能力的研究尚未见报道。本研究以经实验室传代饲养的日本血蜱为实验材料，调查实验室条件下日本血蜱对田鼠巴贝西虫的传播能力。

日本血蜱为中国CDC寄生虫病预防控制所媒介室实验室人工饲养，饲养条件为温度（25±1）℃、相对湿度（85±5）%、光照周期（L:D）为14 h:10 h。田鼠巴贝西虫由中国医学科学院实验动物学研究所提供（编号：ATCC®PRA-99）；3~4周龄雌性BALB/c小鼠和体质量16~18 g的雌性NOD/SCID小鼠均由中国科学院上海实验动物中心提供。

QIAGEN血液和组织DNA提取试剂盒（TaKaRa）；PCR试剂（BioRad C1000 TouchTM）；PCR仪；恒温恒湿培养箱（Froilabo）。

取小鼠血液（红细胞感染率约为50%）0.1 ml，经腹腔接种于雌性BALB/c小鼠。于接种后第2天开始采集尾尖血制作血涂片，吉姆萨染色后镜检以确定是否感染成功，阳性小鼠用于蜱叮咬。

取3个大小不同的收纳盒套在一起，两层盒子间加入适量水。用毛笔将约600只幼蜱刷于2只阳性BALB/c小鼠体表，每只鼠体表约300只幼蜱，将小鼠置于3层收纳盒的最内层，置恒温恒湿培养箱中。收集饱血幼蜱，取20只饱血幼蜱用于DNA提取和PCR检测，剩余饱血幼蜱放入塑料瓶中，置恒温恒湿箱进行蜕皮孵化。幼蜱孵化为若蜱4周后，取200只若蜱用于DNA提取和PCR检测。如若蜱检测结果为阳性，用剩余若蜱叮咬阴性NOD/SCID小鼠。

按相同方法，用200只若蜱叮咬4只阳性BALB/c小鼠。取20只饱血若蜱进行田鼠巴贝西虫检测，其余若蜱蜕皮孵化为成蜱。若蜱孵化为成蜱4周后，取40只成蜱（雌雄各20只）进行检测。若成蜱检测结果为阳性，用剩余成蜱叮咬阴性NOD/SCID小鼠。

由于幼蜱叮咬阳性小鼠发育为若蜱后未检出阳性，而若蜱叮咬阳性小鼠发育为成蜱后检出田鼠巴贝西虫感染，仅用阳性日本血蜱成蜱叮咬阴性小鼠。取阴性NOD/SCID小鼠12只，每只小鼠体表放3对成蜱，成蜱饱血脱落后用于田鼠巴贝西虫检测。隔日采集被成蜱叮咬过的NOD/SCID小鼠尾部血液50 μl，取2 μl用于制作血涂片，剩余血液用于DNA提取和PCR检测。

取接种后第2天的阳性BALB/c小鼠15只，每只小鼠体表放3对成蜱进行叮咬，收集饱血雌蜱置于塑料容器中进行产卵孵化。取产卵后的母体及子代幼蜱（每只成蜱取300只子代幼蜱）进行DNA提取及PCR检测。

按照试剂盒说明书提取蜱及鼠类血液标本的DNA，其中未吸血若蜱以5只/组、子代幼蜱以30只/组进行DNA提取，其余蜱标本（饱血幼蜱、若蜱和成蜱）单只提取。DNA样品用特异性引物Bab1A~Bab4A进行巢式PCR扩增，以检测样品田鼠巴贝西虫感染情况。

第1轮反应引物为Bab1A（5′-CTT AGT ATA AGC TTT TAT ACA GC-3′）和Bab4A（5′-ATA GGT CAG AAA CTT GAA TGA TAC A-3′）；第2轮反应引物为Bab2A（5′-GTT ATA GTT TAT TTG ATG TTC GTT T-3′）和Bab3A（5′-AAG CCA TGC GAT TCG CTA AT-3′）。反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。同时制作鼠类血液涂片，吉姆萨染色后镜检。

约600只幼蜱用于叮咬2只阳性BALB/c小鼠，收获饱血幼蜱513只，取其中20只，每只均提取DNA及PCR检测，结果均为阳性。剩余饱血幼蜱蜕皮孵化为若蜱，共收获若蜱447只。若蜱孵化4周后，取200只进行田鼠巴贝西虫检测，结果均为阴性。后将幼蜱-若蜱阶段经期传播实验重复3次，若蜱检测结果均为阴性，未发现日本血蜱幼蜱-若蜱阶段可经期传播田鼠巴贝西虫。

200只若蜱叮咬4只阳性BALB/c小鼠，共收获饱血若蜱172只，取其中20只进行PCR检测，结果均为阳性；剩余饱血若蜱蜕皮孵化为成蜱，共收获成蜱134只。取雌雄成蜱各20只进行PCR检测，8只雌蜱检测结果为阳性，雄蜱未检出阳性。

取12只阴性NOD/SCID小鼠，每只小鼠体表放3对叮咬阳性小鼠的饱血若蜱孵化的成蜱。其中3只小鼠被2只雌蜱成功叮咬，其余9只小鼠仅被1只雌蜱成功叮咬。共收获饱血雌性成蜱15只，检出阳性2只。12只NOD/SCID小鼠中，有2只小鼠分别于叮咬后第9、10天检出阳性，说明日本血蜱若蜱-成蜱阶段可经期传播田鼠巴贝西虫。

45对阴性成蜱叮咬15只阳性小鼠，共收获饱血成蜱19只，对产卵后饱血雌蜱进行检测，19只均为阳性。每只饱血雌蜱取300只子代幼蜱，以30只/组进行DNA提取和PCR检测，结果全部为阴性，未发现日本血蜱经卵传播田鼠巴贝西虫。

近年来，蜱传疾病越来越受关注，我国报道的人感染蜱传病例亦有增加。田鼠巴贝西虫是重要的人兽共患性蜱传疾病病原体，人感染后可出现疟疾样症状，多数感染者可自愈，但免疫功能受损者可能导致严重性疾病甚至死亡。

国外研究表明，硬蜱属蜱种是田鼠巴贝西虫的主要传播媒介^[5]，其他蜱属的蜱种亦可传播田鼠巴贝西虫，如网纹革蜱（Dermacentor reticulatus）^[14]、嗜群血蜱^[7]和镰形扇头蜱^[8]等。硬蜱的生活史包括卵、幼蜱、若蜱和成蜱4个发育阶段。其中，幼蜱、若蜱及成蜱仅吸血1次，饱血后蜕皮发育为下一个龄期或产卵。硬蜱对病原体的传播途径主要有经期传播和经卵传播两种形式。本研究证实，日本血蜱在若蜱-成蜱阶段可在实验室条件下经期传播田鼠巴贝西虫，但未发现日本血蜱幼蜱-若蜱阶段可传播田鼠巴贝西虫。日本血蜱仅在若蜱-成蜱阶段经期传播田鼠巴贝西虫，可能因若蜱吸血量远高于幼蜱^[15]。同时，若蜱叮咬阳性小鼠蜕皮发育为成蜱后，仅雌蜱获得感染，而雄性成蜱未获得感染，可能因雌性成蜱体型较雄性成蜱大而在若蜱阶段吸血更多，亦可能是雌雄蜱在免疫功能上存在差异或其他原因所致，但感染率性别差异的原因有待进一步研究。上述结果说明，日本血蜱有传播田鼠巴贝西虫的能力，但低于其他常见传播媒介。日本血蜱经卵传播田鼠巴贝西虫，与其他研究结果相同^[16]。

本研究发现，阳性成蜱再次吸血后，田鼠巴贝西虫的感染率由吸血前的40.00%下降至13.33%，其作用机制尚不明确，可能与吸血诱导昆虫免疫系统产生免疫应答有关^[17-18]。本研究未对日本血蜱传播田鼠巴贝西虫的能力进行定量研究，对于我国其他蜱种是否传播田鼠巴贝西虫、不同蜱种的传播能力差异及其作用机制等问题有待深入研究。