鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis，鼠疫菌）可引起自然疫源性烈性传染病，其发病急、传播快、病死率高，因此，鼠疫菌的快速检测和鉴定具有重要的意义^[1]。目前，鼠疫菌的检测方法主要有经典的“四步检验法”、血清凝集法和PCR检测法，但每种方法均存在不足^[2-6]。鼠疫菌的pla基因片段位于鼠疫菌的Pst质粒的遗传信息中，具有相当稳定及非常特异的分子生物学特征，无论典型或非典型的鼠疫菌均具有该特性。大多PCR检测方法将pla基因片段作为检测目标，但易导致假阳性和假阴性。Southern印记杂交（Southern blot）技术是分子生物学领域较经典的检测方法，其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，该杂交过程具有高度特异性^[7]。Southern印记杂交技术十分灵敏，在理想条件下，用放射性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术，即便每条电泳带仅含2 ng DNA也可被清晰地检测出^[8-10]。本研究通过Southern印记杂交技术检测鼠疫菌的pla基因片段，并与市售成品试剂盒的检测结果进行对比，验证Southern印记杂交技术在鼠疫菌pla基因片段检测中的有效性。

1 材料与方法 1.1 鼠疫菌pla基因片段

鼠疫菌pla基因质粒由中国检验检疫科学研究院惠赠。

1.2 鼠疫菌pla基因质粒的验证

参照《国境口岸鼠携带鼠疫杆菌和汉坦病毒快速检测方法》（SN/T 2616-2010）中鼠疫菌pla基因的引物片段设计引物。PCR反应体系：取质粒2 μl，上、下游引物各1 μl（10 μ mol/L），Taq DNA聚合酶（5 U/μ l）0.5 μ l，dNTPs 4 μl（2.5 mol/L），10×PCR缓冲液5 μl，灭菌双蒸水36.5 μl；反应体系：95 ℃预变性5 min，之后94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，送至华大基因公司测序。

1.3 地高辛（DIG）标记探针及标记效率的检测

通过美国国立生物技术信息中心（NCBI）查阅pla基因片段序列，设计引物通过PCR从鼠疫菌质粒上扩增病毒DNA序列的特异片段并做探针标记。PCR法标记探针：以pla质粒为PCR模板，具体过程参照PCR法DIG探针合成试剂盒（Roche Cat.#REF 11636090910，11340020）说明书，标记结束后取2 μl标记产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测探针标记效率及产量。

1.4 基因组DNA电泳检测

将鼠疫菌质粒5 μl进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶大小为70~80 mm，电压30 V，电泳时间30 min，保持电泳槽低温状态。

1.5 真空转膜及固定

对琼脂糖凝胶进行变性和中和处理，处理过程按DIG标记探针试剂盒说明书进行。转膜用785型真空转膜仪（Bio-Rad）进行，参照周长发等^[5]方法。转膜结束后采用紫外交联（1200 J）固定膜上DNA。

1.6 杂交及信号检测

杂交具体过程参照试剂盒说明书，杂交液用量5 ml，42 ℃预杂交1~3 h。探针使用量10 μl，杂交液用量5 ml，于40 ℃杂交18 h。杂交结束后进行洗膜处理，使用洗液Ⅱ（0.5×SSC，0.1% SDS）于64 ℃洗膜。封闭液孵育30 min，抗体工作液孵育1 h，其余过程与试剂盒说明书相同。最后于黑暗静置状态下进行显影操作，时间为30 min~ 12 h，显影结束后，尼龙膜照相留存。

1.7 鼠疫菌质粒核酸检测

采用鼠疫菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）（Cat.#DA-BN122，2016001，中山大学达安基因股份有限公司）进行检测。

2 结果 2.1 质粒片段的有效性

通过PCR及基因测序对所得样本的有效性进行判断。所需目的条带大小符合实验目的，见图 1。对质粒的PCR产物进行测序，经Blast比对，与鼠疫菌1045 plasmid pPCP，complete sequence的序列一致性达99%，见图 2。

2.2 探针标记效率

PCR法探针标记效率的结果如图 3所示，阳性对照DNA和PCR法均显示7个稀释点。经显色亮度比对，PCR法标记探针稀释浓度为0.3 pg/μl时，其显色强度与随机引物法标记的探针稀释浓度为3 pg/μl时一致。由此可见，PCR法标记探针的效率较好。

2.3 Southern印记杂交技术检测

PCR法标记的探针杂交背景浅，杂交条带清晰，可直观地观察pla基因拷贝数，杂交效率较高，见图 4。

2.4 鼠疫菌质粒核酸检测结果

该鼠疫菌质粒模板经实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测显示为阳性，见图 5。

3 讨论

自20世纪50年代开始，研究者采用经典方法——常规检测法检测鼠疫菌，检测过程主要有显微镜涂片检查、分离培养、鼠疫噬菌体裂解试验和动物实验，涂片后利用革兰染色、Wayson染色或免疫荧光法进行观察^[11]，分别从细菌形态鉴定及F1抗原检测及毒力判定等方面全方位地鉴定鼠疫菌，有利于对鼠疫疫源地及其流行强度的研究，但该方法耗时长、过程复杂、需研究者有较丰富的经验^[12]。

近年来，随着分子生物学技术的发展，越来越多的生物技术应用于鼠疫菌的检测、诊断、鼠疫监测及相关科学研究中。本研究发现，采用Southern印记杂交技术与qRT-PCR成品试剂盒检测鼠疫菌结果相同，通过Southern印记杂交技术可明确地检测到pla基因，且该技术所需实验设备简单、相关费用较少，较适于口岸地区实验条件及经费有限的实验室开展工作；虽然Southern印记杂交技术较qRT-PCR法耗时相对较长，但其可有效地避免qRT-PCR出现假阳性或假阴性结果，是目前分子生物学检测技术的主流。

Southern印记杂交技术与鼠疫菌传统四步法比较，其检测时间短、生物安全性较高，不受实验室培养条件的限制，可有效地避免动物接种感染过程的风险，更适用于鼠疫菌的检测，对鼠疫菌引发的突发公共卫生事件有重要意义。