鼠疫是由鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis，鼠疫菌）引起的一种自然疫源性传染病，在历史上曾经给人类社会带来深重灾难。当前，鼠疫自然疫源地动物鼠疫感染人和鼠疫菌被用作生物恐怖袭击的威胁同时存在，因此鼠疫依然是一种严重威胁着人群健康、国家安全和社会稳定的传染病^[1]。我国鼠疫自然疫源地面积广阔，类型多样，分布在全国19个省（自治区）的305个县（市、旗）^[2]。新疆维吾尔自治区（新疆）陆地面积较大，其生态环境复杂，鼠疫菌的宿主和传播媒介种类也繁多，分离自新疆的鼠疫菌亦表现出多样性较高的表型和遗传特征^[3-4]。

规律聚集的间隔短回文重复（CRISPR）是一类由同向重复序列（direct repeat，DR）和将其分隔开的间区序列（spacer）构成特殊结构的重复序列，广泛分布于原核生物基因组中。CRISPR位点可作为细菌分型和进化分析的理想分子靶标^[5]。鼠疫菌基因组中存在3个CRISPR位点，我国学者建立了基于CRISPR位点的分子分型方法^[6]，该方法操作简单快速、结果稳定、重现性好。本研究利用该方法对分离自新疆地区的58株代表性鼠疫菌进行了基因型别鉴定及菌株间进化关系的初步分析。

58株鼠疫菌于1956-2006年分离自新疆地区，分离地点和宿主均具有较好的代表性，菌株信息见表 1。

表 1 实验菌株信息 Table 1 Information of tested strains in this study

表选项

采用以PCR技术和序列测定为核心的CRISPR型别鉴定方法。

引物序列参照文献[6]，由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

配制25 μl的反应体系，包括2× TransTaq-T PCR SuperMix（北京全式金生物技术有限公司）12.5 μl，上、下游引物各1 μl，2 ng/μl的DNA模板1 μl，以及超纯水9.5 μl。PCR扩增条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃再延伸5 min。

以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，将PCR产物送天一辉远生物科技有限公司进行测序。

鼠疫菌基因组中有3个CRISPR位点，分别为YPa、YPb和YPc，58株新疆鼠疫菌在这3个CRISPR位点中的PCR产物测序资料整理形成Word文档，利用Word文档的查找功能，按照DR和spacers序列库确定每一个CRISPR位点的间区序列种类和排列情况，并将结果整理到表格中，间区序列阵列的书写规则沿用文献中介绍的方法^[6]。应用Bionumerics软件对spacer和排列关系进行聚类分析。

2.1菌株的间区序列多样性58株鼠疫菌共鉴定出42个间区序列，YPa、YPb和YPc位点中分别有26、12和4个，未发现新的间区序列。其中，YPa位点上的a35仅存在于19号菌株，a51仅出现在16号菌株。YPc位点上的c7序列只存在于新疆尼勒克县的鼠疫菌分离株，见表 2。

表 2 58株鼠疫菌的3个CRISPR位点间区序列阵列 Table 2 Spacer arrays in three CRISPR loci of 58 Y. pestis strains

表选项

YPa、YPb和YPc位点分别鉴定到14、6和3种间区序列阵列，每株鼠疫菌在3个CRISPR位点上的间区序列阵列见表 2。根据3个位点上的间区序列阵列差异综合分析，将58株鼠疫菌分为16个基因型（图 1），其中基因9型、10型、11型和16型是本研究新发现的CRISPR型别，未见报道。

图 1 58株新疆鼠疫菌的Bionumerics聚类图 Figure 1 Dendrogram of fifty-eight Y. pestis strains from Xinjiang, generated by Bionumerics software

图选项

新疆地区生态地理环境多种多样，鼠疫菌的宿主和传播媒介种类众多，为其种群演化和扩散提供了丰富的生态系统资源。新疆天山地区的灰旱獭（Marmota baibacina）和长尾黄鼠（Spermophilus undulatus）森林草原鼠疫自然疫源地被认为是我国鼠疫自然疫源地的最早起源^[7]。本研究利用CRISPR分型方法将58株鼠疫菌分为16个基因型，不同型别的鼠疫菌在地理分布上具有明显的区域性，如新疆乌恰县的6株鼠疫菌均为基因3型。分离自新疆和田地区的6株菌中，除1株被鉴定为基因6型外，其余5株全部属于基因8型，两个基因型的唯一区别在于YPb位点的间区序列阵列在基因6型中表现为b1-b2-b3-b4，而在基因8型中表现为b1-b2-b3-b4′，间区序列b4′较b4在核酸序列的3′末端增加了1个鸟嘌呤，推测基因6型可能是新疆和田地区的鼠疫菌进化过程中的过渡株，而基因8型鼠疫菌则是新疆和田地区的主要流行株。分离自新疆和田地区的鼠疫菌另一个特征是在YPa位点有1个代表性间区序列a68，可看作是该地区特异性间区序列。

所有基因7型的鼠疫菌株均分离自新疆准噶尔盆地大沙鼠（Rhombomys opimus）及其体表寄生蚤，该型与基因8型在YPb位点上均含有间区序列b4′，两型菌株的分离地相距较远，宿主也完全不同，但两者可能有1个共同的含b4′的鼠疫菌祖先，新疆准噶尔盆地的鼠疫菌与新疆和田地区的喜马拉雅旱獭（M. himalayana）鼠疫菌在生化特征上也完全相同^[8]，证实了两型鼠疫菌间有较近的亲缘关系。

6株分离自新疆尼勒克县的鼠疫菌分属于4个基因型，即基因4型、9型、10型和11型。基因9型、10型和11型鼠疫菌亲缘关系十分接近，两者在YPb和YPc位点上的间区序列阵列完全相同，仅在YPa位点上有很小的差异，基因11型为在间区序列a37的3′末端增加了1个胸腺嘧啶而进化为基因9型和10型。此外，YPc位点上的c7是新疆尼勒克县菌株特有的间区序列。分离自该地区长尾黄鼠的1株基因4型鼠疫菌则与基因9型、10型和11型菌株的CRISPR位点遗传特征差异较大，而与新疆乌恰县的鼠疫菌关系更为密切。

基因16型的鼠疫菌株全部于1959-1998年分离自新疆玛纳斯县，但菌株的CRISPR型别完全相同，说明该型菌株是新疆玛纳斯县的主要流行株，3个CRISPR位点的遗传特征十分稳定，基因16型也是新发现的鼠疫菌CRISPR型，该型别在YPa位点的间区序列阵列为a1-a3-a4-a6-a37-a46-a47-a48-a71，间区序列a71位于a37-a46-a47-a48的右侧，以往研究a71均位于中间位置，形成a37-a39-a71-a46-a47-a48的区序列阵列形式。目前研究认为，鼠疫菌中新间区序列的增加常在引导序列一端，故推测新疆玛纳斯县的鼠疫菌祖先可能有a37-a39-a71-a46-a47-a48甚至更长的间区序列阵列，在进化过程中偶然发生了a71的缺失，但为适应生存环境，在后来的某个时间又重新获得了a71间区序列，同时说明，带有a71基因序列的噬菌体广泛存在于该地区。

新疆克拉玛依市、奇台和乌鲁木齐县的分离菌株CRISPR型别多样性较高，包括基因1型、3型、5型、7型、13型和14型，且该基因型分散在6个不同的小分支中。故推测新疆地区的鼠疫菌很可能起源于新疆北部天山山地和准噶尔盆地交界地区，逐步向南传播扩散。随着鼠疫监测范围的扩大及检测菌株数的增加，将有更多的鼠疫菌CRISPR型别被发现，有助于全面了解新疆地区乃至全国鼠疫菌的起源、传播和进化。