阿拉山口口岸是我国西部地区唯一具有铁路、公路的国家一类口岸^[1]。该区域小型哺乳动物物种丰富，达5目9科15属19种^[2]。多房棘球蚴（Echinococcus multilocularis）成虫主要寄生于狐、狼、犬和猫等动物，中间宿主多为啮齿动物，主要流行于北半球的高纬度地区^[3-4]。2004－2008年新疆地区共报道包虫病2 895 例，其中囊型包虫病占90%以上，同时北疆的绵羊包虫病感染率高于南疆和东疆^[5-6]。随着“一带一路”经济带的快速发展，频繁的贸易往来增加了鼠类等媒介生物的跨境传播。本研究对阿拉山口口岸地区多房棘球蚴线粒体NADH脱氢酶亚基1（NADH dehydrogenase subunit 1，ND1）基因序列进行分析，为其监控提供科学依据。

鼠类样本于2014年采自阿拉山口城区（6只）、郊区（21只）及野外区（164只）三大区域，共4属7种191只。

总DNA提取试剂盒（DNeasy^® Blood & Tissue Kit，QIAGEN）；Taq DNA聚合酶、dNTP、T-载克隆试剂盒（pMD^TM19-T Vector Cloning Kit）均购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒，购自北京TIANGEN生物工程有限公司；其他试剂均为分析纯。

对鼠标本逐只解剖，用肉眼察看脏器病变情况，剪取包囊约25 mg，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3次，按照总DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，产物于-20 ℃保存备用。

多房棘球蚴PCR引物参照文献^[7]序列，ND1基因全长序列参考杨俊萍等^[3]报道，经拼接后得到全长基因，引物序列见表 1。

表 1 PCR引物序列 Table 1 Primers of ND1 gene sequences

表选项

反应体系50 μl，其中dNTP（2.5 mmol/L）4 μl、10×PCR Buffer 5 μl、Taq DNA聚合酶（5 U/μl）0.2 μl、引物各1 μl、模板1 μl、ddH₂O补至50 μl混匀。扩增参数：95 ℃预变性3 min；95 ℃30 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，35个循环；延伸72 ℃ 5 min。取6 μl PCR扩增产物和2 μl Loading Buffer混合液，于1.5%琼脂糖（含GenGreen核酸染料）凝胶中100 V电泳45 min，置凝胶成像仪中观察结果。

利用胶回收试剂盒将目标片段PCR产物进行纯化回收，将其与pMD19-T Vector进行连接，转化JM109大肠埃希菌。挑取阳性克隆菌落接入少量LB培养基（Amp+，100 mg/ml）中，150 r/min，37 ℃振荡培养过夜。参照质粒提取试剂盒说明提取质粒，送至北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司进行测序。

将测序结果在GenBank进行Blast同源性分析，使用Mega 6.0软件构建分子遗传进化树，并对所得氨基酸序列进行跨膜结构、信号肽、B细胞抗原表位及二级结构、三级结构预测分析。

剖检查看191只鼠样本，其中有3只大沙鼠（Rhombomys opimus）携带包囊，携带率为1.57%（3/191）。包囊形状大小不等，呈乳白、灰白色的圆形、椭圆形串珠样结节。

PCR扩增多房棘球蚴ND1基因显示，Cest引物在395 bp处出现特异性条带；EM731和EM631引物分别在731 bp和631 bp位置出现特异性条带，见图 1。

图 1 多房棘球蚴ND1基因PCR扩增结果 Figure 1 The products of PCR of the ND1 gene from the E. multilocularis

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Blast分析表明，Cest引物序列与GenBank中多房棘球蚴（AB720065）同源性达100%；分子遗传进化树显示，与多房棘球蚴（AB720065、AB621800、EU704124、EU704123和AB018440）聚为一支，见图 2a。引物EM731和EM631扩增所得序列经拼接可得到全长为894 bp的ND1基因片段。Blast分析显示，与日本的多房棘球蚴（AB018440）同源性为100%；分子进化树显示与多房棘球蚴（EU704123和AB018440）聚为一支（图 2b）。

图 2 基于Cest引物（a）和多房棘球蚴ND1基因（b）遗传进化树 Figure 2 Phylogenetic tree of Cest primer and ND1 gene

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阿拉山口口岸多房棘球蚴ND1基因全长894 bp，编码297个氨基酸，蛋白理论分子质量为7.6×10³，理论等电点5.31。氨基酸序列信号肽分析显示此蛋白无信号肽（图 3）。二级结构预测显示该蛋白以α-螺旋（占二级结构的51.18%）结构为主，β-折叠74个（占二级结构的24.92%），无规则卷曲47个（占二级结构的15.82%）（图 4）。

图 3 多房棘球蚴ND1基因蛋白信号肽预测结果 Figure 3 Signal peptide prediction of ND1 gene protein of E. multilocularis

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图 4 多房棘球蚴ND1基因蛋白3D结构 Figure 4 3D structure analysis of ND1 gene protein of E. multilocularis

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新疆地区为棘球蚴病的重灾区，对其进行预防控制尤为重要。目前，OIE将PCR方法作为多房棘球蚴的确诊方法^[8]。此次研究使用OIE推荐的多房棘球蚴ND1基因Cest引物，成功地检测到多房棘球蚴，为阿拉山口口岸出入境动物棘球蚴等病原体的快速检测提供了依据，对提高口岸疾病监测能力具有重要意义。

大沙鼠种群是中哈边境地区的优势种，通过分子生物学检测发现大沙鼠携带多房棘球蚴，与前期研究一致^[9]。大沙鼠主要分布在阿拉山口口岸野外区，一旦大沙鼠扩散到城区，将会对人畜的健康造成严重威胁。因此，相关部门应加强对口岸城区鼠类监测和灭鼠工作。同时，大沙鼠携带多房棘球蚴是长期存在于阿拉山口还是随交通工具、货物和迁徙传入我国，值得关注。

不同的分子结构特征对于研究多房棘球蚴的作用方式具有重要意义^[10]。生物信息学结果显示，多房棘球蚴ND1基因蛋白无信号肽，二级结构以α-螺旋为主，并预测其3D结构。了解阿拉山口地区ND1基因蛋白的部分功能特性，对该病的致病机制、诊断和防控具有重要的现实意义。

近年来我国口岸在入境国际交通工具、集装箱和货物中发现并捕获大量输入性医学媒介生物^[11]。有害生物借助交通工具、货物传入的风险增大。因此，应加强与哈萨克斯坦相关部门的合作，开展多房棘球蚴的检测工作，采取相应的措施科学防控其传播。