河北省鼠疫自然疫源地位于康保县境内（42°04′N，144°45′E），面积1 000 km²，北与内蒙古自治区相接，南与河南、山东省毗连，西与山西省相邻，东临渤海，东北与辽宁省相邻，环抱北京及天津市。1972年首次分离出鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis，鼠疫菌）而发现该疫源地，建国后截止目前共发生过4次动物鼠疫流行，分离菌株273株，经生化鉴定菌株生态型属鄂尔多斯高原型，为内蒙古长爪沙鼠（Meriones unguiculatus）鼠疫疫源地的延伸^[1]。为探讨鼠疫菌在河北省鼠疫疫源地进化过程中是否发生遗传变异及流行规律，利用DFR片段对该疫源地的116株菌株进行分型实验。

实验所用116株鼠疫菌均分离于河北省鼠疫疫源地，宿主均为长爪沙鼠。1971－1972年分离18株，1994－1995年分离65株，2002－2003年分离27株，2005年分离6株，见表 1。对照采用62004和82009混合DNA。

表 1 实验所用菌株信息 Table 1 The information of the Y. pestis stains

表选项

PCR扩增仪（杭州博日科技有限公司），高速台式离心机（Eppendorf 5424），水平电泳仪（北京市六一仪器厂），凝胶成像仪（上海基因有限公司）。DNA提取试剂盒购自Qiagen公司，PCR扩增试剂购自北京全式金生物技术有限公司，DL500 Marker购自宝生物工程（大连）有限公司，100 bp Marker购自北京赛百盛基因技术有限公司，琼脂糖购自西班牙Biowest。

查阅文献，引物选择22对DFR和pMT1质粒进行合成，引物信息见表 2。

表 2 引物序列信息 Table 2 The primer information for Y. pestis

表选项

冻干菌株经营养琼脂培养基28 ℃ 24～48 h复苏，分离培养，做噬菌体实验，用Qiagen公司试剂盒提取DNA。

①反应体系：去离子水将提取的鼠疫菌DNA模板10倍稀释，采用25 μl反应体系，其中SuperMix混合液12.5 μl，上下游引物各1.0 μl，模板1.0 μl，补水至25.0 μl；②反应条件：DFR01～17、DFR20～22为94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min。30个循环。72 ℃延伸5 min。DFR18和DFR19的退火条件为56 ℃ 30 s，其他条件同上。

扩增产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳，对照采用62004和82009的混合物，120 V，30～60 min。

在凝胶成像仪下读取结果，对照扩增出全部条带时结果有效，样品出现条带者记为“1”，未出现条带者记为“0”。

对照DNA所有条带，经过多次重复实验，22个差异区段中，116株鼠疫菌扩增产物均缺少DFR01、DFR06、DFR07、DFR13和DFR15～18片段。通过与周冬生等^[2]DFR分型系统比对，河北省分离的鼠疫菌归为基因17型，与基因11型比较，缺少DFR18，见图 1、2。

图 1 23对引物分别对野生菌株DNA及对照DNA的扩增结果 Figure 1 The electrophoretogram of the wild Y. pestis strain and control strain amplified with DFR01-22 and pMT1

图选项

注：1～22. 表示引物DFR01～22； 23. pMT1。 图 2 22株鼠疫菌对DFR18的PCR扩增结果 Figure 2 The electrophoretogram of the 22 Y. pestis strains amplified with DFR18

图选项

通过对分离的116株鼠疫菌进行DFR实验，最终结果显示所有实验菌株均为一个DFR基因型别，与之前进行的MLVA（多位点可变数目串联重复序列分析）实验结果一致^[3]，说明河北省鼠疫疫源地的鼠疫菌菌型单一，在遗传进化过程中并未发生变异。

截止到目前河北省鼠疫疫源地共发生4次动物间疫情，流行地区主要集中在与内蒙古自治区化德县、白旗、太仆寺旗相毗邻的康保县北部^[4]，以康保牧场为主要疫点，照阳河镇和北沙城为散在疫点，发生疫情的地区相对集中，流行环境并无较大变化。因此，鼠疫菌在该疫源地进化过程中未发生遗传变异，基因分型保持一致。

河北省鼠疫疫源地虽属于长爪沙鼠鼠疫疫源地，在生态分型上菌株属于鄂尔多斯高原型，但基因分型存在差异，其中分离自内蒙古自治区的菌株主要以基因11型为主^[5]，而分离自河北省鼠疫疫源地的菌株则以17型为主。由此推测，鼠疫菌在经过古老变种到中世纪变种后，在河北省鼠疫疫源地进化演变的过程中，丢掉DFR18而成为基因17型，即菌株的某些生化特征不同于内蒙古自治区分离的菌株^[6]。因此，基因分型能更好地区分不同来源的菌株，对疫情的追根溯源更准确。

1949年以后河北省鼠疫疫源地未发生过人间鼠疫流行，仅4次动物间鼠疫，而最近的1次距今已10年，疫情的平缓流行，可能与科学的防控措施及鼠疫菌的毒力有关，经实验证实河北省鼠疫菌达中等毒力水平^[7]，半数致死量（LD50）要几万个菌，表型的改变是基因组进化的结果。基因缺失是细菌基因组进化的主要策略之一，功能性基因的缺失直接导致进化中间体与其祖先之间表型特征不一致^[8]。

基因的缺失不仅导致细菌表型的变化，也使进化后的菌株局限于特定范围流行^[9-11]。鼠疫菌为适应生态环境的变化而多种基因型共存或演化出新基因型，预示动物间鼠疫在该区域内可持续流行，河北省鼠疫菌株基因型别单一，故流行地区有限，流行程度较弱。通过基因分型追踪溯源并揭示流行规律，可更好地进行防控工作。