阿拉山口口岸位于我国西部，介于阿拉套山与巴尔鲁克山间，是目前唯一集铁路、公路、管道原油运输为一体的国家一类陆路口岸，毗邻哈萨克斯坦塔尔迪-库尔干州，是中亚荒漠和准噶尔盆地间唯一的通道。地处82°23′～84°53′E，43°31′～45°22′N，属极端干旱的温带荒漠类型。鼠类鉴定采用传统的形态学方法，鉴定人员需具备丰富的物种分类经验，易造成人为误差，影响鉴定结果^[1]。在边境口岸地区建立快速识别鼠类样品的方法，对监控鼠传疾病有重要意义。

DNA条形码技术，通过分析一个标准目的基因的DNA序列从而对物种进行快速鉴定^[2]。近年来，已被广泛应用于发现“隐含种”、鉴定残缺标本及识别宿主动物等^[3]。线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）基因是线粒体蛋白编码基因之一，可自由变异，且COⅠ演化速率是其他蛋白编码基因的3倍，其变异可将物种区别开来。COⅠ有较少的插入和缺失，两端序列有相对的保守性，是较好的分子标记^[4]。线粒体细胞色素b（Cytb）基因具有母系遗传、高突变率、基因结构简单及无组织特异性等特点，适用于种间、种下水平的鉴别研究，是理想的分子标记^[5]。该文使用COⅠ和Cytb 基因对中国-哈萨克斯坦边境（中哈边境）阿拉山口地区的常见鼠种进行鉴定，验证DNA条形码技术在鼠类鉴定中的可行性。

2013年1月至2014年6月采用鼠夹法^[6]，在城区、郊区及野外三大区域采集鼠种。

依据盛和林^[7]检索表，对捕获鼠类进行形态学鉴定。

剪取鼠肝脏约25 mg，用PBS缓冲液冲洗3次，按照DNeasy- Blood & Tissue Kit（QIAGEN）说明书提取DNA，-20 ℃保存备用。

以线粒体COⅠ和Cytb基因为目的片段，引物序列见表 1。PCR扩增反应体系为50 μl：其中dNTP（2.5 mmol/L）4 μl、10×PCR Buffer 5 μl、Taq DNA聚合酶（5 U/μl）0.2 μl、引物各1 μl、模板1 μl、ddH2O补至50 μl，混匀。COⅠ基因扩增参数：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 45 s、54 ℃ 60 s、72 ℃ 1 min，35个循环；延伸：72 ℃ 10 min；Cytb 基因扩增参数：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 60 s、72 ℃ 1 min，35个循环；延伸：72 ℃ 10 min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，将其送至北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司进行测序。

表 1 COⅠ和Cytb基因PCR扩增引物序列 Table 1 Primers sequences for PCR of COⅠ and Cytb

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将测序序列录入GenBank进行Blast比对，使用Mega 6.0软件，以最大似然法（maximum likelihood，ML）构建系统发育树。

共捕获鼠类4属7种382只，其中大沙鼠（Rhombomys opimus）230只，红尾沙鼠（Meriones libycus）45只，褐家鼠（Rattus norvegicus）54只，小家鼠（Mus musculus）19只，灰仓鼠（Cricetulus migratorius）16只，子午沙鼠（Meriones meridianus）9只，五趾跳鼠（Allactaga sibirica）9只。

得到COⅠ基因序列16条，Cytb 基因序列25条。其中大沙鼠COⅠ基因序列4条，Cytb 序列5条。褐家鼠在COⅠ和Cytb 基因中各得到2个单倍体。采集的灰仓鼠COⅠ基因序列与GenBank中记录的我国1979年采集的藏仓鼠（Cricetulus kamensis）（KF152990）同源性为100%（627/627），与美国的灰仓鼠（HM102297）同源性为96.2% （603/627）；而Cytb 基因显示与巴基斯坦记录的灰仓鼠（AY288508）同源性为97.7%（1 075/1 100）。子午沙鼠COⅠ基因序列显示与我国郑氏沙鼠（Meriones chengi）（KF152978）同源性最高，同源性为99.5%（642/645），而与我国子午沙鼠（KR013227）同源性为89.1%（621/697）；Cytb 基因则显示与我国新疆乌鲁木齐县、阜康县的子午沙鼠（AB381896）同源性最高。各鼠种Blast比对结果见表 2。

表 2 COⅠ和Cytb基因序列Blast比对结果 Table 2 The Blast results of the COⅠ and Cytb gene

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分子遗传进化树显示各鼠种均可形成独立的分支，COⅠ基因分子遗传进化树显示遗传距离为1.993 567 05；Cytb 基因分子遗传进化树显示遗传距离为1.900 183 84。阿拉山口子午沙鼠COⅠ基因遗传进化树显示与郑氏沙鼠（KF152978）聚为一支，并与子午沙鼠（JX962290、KC193081、KF152977和KR013227）聚为一组，见图 1；而Cytb基因分子遗传进化树显示与子午沙鼠（AB381896、JQ065570）聚为一组，见图 2。灰仓鼠COⅠ基因显示与藏仓鼠（KF152990）和灰仓鼠（HM102297）聚为一支，见图 1，而Cytb基因遗传进化树显示与灰仓鼠（AJ973387、AY288508）聚为一支，见图 2；其他5种鼠鉴定结果与形态学鉴定相同。

图 1 基于线粒体COⅠ基因构建分子遗传进化树 Figure 1 Phylogenetic tree based on COⅠ gene of representative rodent specimens

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图 2 基于线粒体Cytb 基因构建分子遗传进化树 Figure 2 Phylogenetic tree based on Cytb gene of representative rodent specimens

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随着分子生物学、分子系统学的发展，限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）、限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）、SSR标记（微卫星位点PCR扩增，SSR-PCR）、分子标记技术（ISSR）、单核苷酸多态性（SNP）等一系列分子遗传标记技术已应用于物种分类鉴定^[9]。鲁亮等^[10]利用DNA条形码技术在中哈边境的子午沙鼠中发现1个隐含种，同时明确2种大鼠属鼠种的系统关系。杨志俊和胡云^[11]运用随机扩增多态DNA（RAPD）技术，以强带差异来区分鼠类遗传多态性，判定鼠种及其来源。本研究利用COⅠ和Cytb基因位点对阿拉山口口岸地区常见鼠种进行分子鉴定，结果表明COⅠ基因Blast分析中子午沙鼠和灰仓鼠形态学鉴定结果与分子生物学鉴定结果不一致，但分子遗传进化树结果与形态学鉴定一致；而Cytb 基因通过Blast和分子遗传进化树分析均与形态学鉴定一致。联合使用COⅠ和Cytb 基因可准确地鉴定阿拉山口口岸地区的鼠种。因此，应选择合适的方法对鼠种进行分子鉴定，提高鉴定的准确性。

在媒介生物鉴定时，建议利用传统形态学与分子生物学相结合的方法。应用分子生物学技术可发现“隐含种”，同时纠正传统形态学鉴定中的错误。利用多基因位点进行分子生物学鉴定，可确保分子生物学鉴定的准确性。因DNA条形码数据库处于建设阶段，应广泛收集DNA条形码数据，选择合适的DNA条形码基因位点，联合使用多种基因位点，满足以DNA条形码为基础快速种类鉴定的需求^{[1, 3, 12]}。

新疆维吾尔自治区地处我国西北，边境线长达5 600 km，与8个国家相邻，是我国与中亚贸易往来的门户。阿拉山口作为“一带一路”经济带的桥头堡，随着进出口贸易的快速发展，增加了鼠类等媒介生物随交通工具、集装箱传入我国的风险。因此，准确快速的媒介生物鉴定方法显得尤为重要，可为口岸地区鼠类的分子生物学鉴定提供依据，同时对加强监测口岸医学媒介生物有重要指导意义。