DNA条形码技术是应用生物本身所具有的一段或几段易扩增的、种间差异显著大于种内差异的DNA片段来鉴别物种的新技术^[1]。目前，医学媒介生物种类鉴定以传统的形态鉴定为主，尤其是以雄虫的外生殖器为主要鉴别特征，雌性蝇类往往无法准确鉴定^[2]。且传统的形态鉴定需具备专业形态鉴定知识，鉴定结果受主观性影响较大，对样品形态完整性要求较高和检测周期长等缺点，有一定的局限性。DNA条形码技术给医学媒介生物分类学研究带来了新气象，同时也为出入境卫生检验检疫技术能力的提升带来新期待^[3-4]。本研究对广东中山出入境检验检疫局于2015年3月26日在小榄港口岸截获从爱尔兰进口的废旧瓦楞纸箱中的雌性蝇类，通过DNA条形码和形态鉴定，确定其为粗野粉蝇（Pollenia rudis），并与其在形态相似的伪粗野粉蝇（P. pediculata）DNA条形码和形态上进行比较，证实DNA条形码可快速准确鉴定雌性个体。

1 材料与方法 1.1 材料

所用样本为2015年3月26日从爱尔兰进口的废旧瓦楞纸箱中截获的2只外部形态相似的丽蝇科雌虫，将其制作成针插标本。其中1只参照《中国常见蝇类检索表》第2版^[5]鉴定为伪粗野粉蝇，作为研究的对比参照标本。另1只据现有资料无法根据形态确定种类，仅进行了拍照留档，见图 1。

1.2 方法 1.2.1 DNA提取

其1只后足，用动物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，目录号DP304-03），按照说明书指导提取基因组DNA。

1.2.2 DNA扩增

PCR扩增所用引物：LCO1490 5′-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3′；HCO2198 5′-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3′^[6]，由宝生物工程（大连）有限公司合成。EX-Taq DNA聚合酶、dNTP等PCR试剂购自宝生物工程（大连）有限公司。PCR反应体系（50μl）：10倍PCR缓冲液5μl；正、反向引物（20 nmol/μl）各2μl；dNTP（10μmol/μl）2μl；Ex-Taq DNA聚合酶（5 U/μl）1μl；模板DNA（50 ng/μl）3μl；无菌水定容到50μl。EX?Taq DNA聚合酶扩增条件：94℃变性5 min；94℃30 s，50℃30 s，72℃1 min，反应30个循环；72℃延伸10 min。

1.2.3 纯化

采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根生化科技有限公司，目录号DP210），按照试剂盒说明书对PCR产物进行纯化。Loading Buffer、DNA MarkerⅡ、SYBR GreenⅠ购自天根生化科技有限公司。

1.2.4 克隆

采用pGM-T连接试剂盒（天根生化科技有限公司，目录号VT202-02）对纯化的PCR产物进行连接和转化，随机挑取白色菌落进行PCR检测，以确定克隆阳性。

1.2.5 测序

随机挑选3个阳性菌株送交上海立菲生物科技有限公司测序。

1.3 结果判定

将测序得到的同一个体的3条序列进行比对，3条序列完全一致，因此仅保留1条序列用于分析。所得序列经Mega 5.10软件^[7]验证图谱为有效序列，去掉两端的引物得到全长为658 bp的有效序列，用于后续分析。

1.4 形态鉴定复核

根据DNA条形码鉴定结果，参照Rognes^[8]和《中国常见蝇类检索表》^[5]，使用体视显微镜（型号：ZEISS Discovery.V12）对标本进行鉴定复核，并与参照标本进行比对。

2 结果 2.1 粗野粉蝇与伪粗野粉蝇序列分析

将序列在BOLD和NCBI中进行比对，在BOLD中的比对结果为100%的粗野粉蝇，在NCBI Blast结果中表明，截获蝇类的序列与GenBank中公布的粗野粉蝇（登录号：KT368817）的细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）序列相似度为100%。将测得的序列上传至GenBank，登录号为KT368665。

截获蝇类的序列碱基组成见表 1，该蝇类长658 bp的COⅠ碱基序列中，碱基T的含量最高，为37.84%；其他碱基含量由高到低依次为碱基A（28.88%）、C（16.71%）、G（16.57%），碱基（A+T）的含量为66.72%，与昆虫线粒体DNA中碱基（A+T）的含量较高而碱基（G+C）的含量偏低的相关研究结果相符合^[9-11]。

参照标本伪粗野粉蝇的COⅠ序列在BOLD中的比对结果为100%的伪粗野粉蝇，在NCBI Blast结果中表明，参照标本的序列与GenBank中公布的伪粗野粉蝇（登录号：KJ443839）的COⅠ序列相似度为99.54%。截获蝇类的序列与参照标本的序列进行比对，在658 bp的DNA条形码序列上有32个核苷酸的差异，相似度仅为95.14%，两者之间的差异远大于DNA条形码判断种的界限（2%）^[12]。

2.2 Neighbor-Joining（NJ）树的构建与分析

用Mega 5.10软件对所测的2条序列及所引入的6条在NCBI中搜索到相似度高的其他蝇种的序列，以家蝇为外群，选用Kimura 2-parameter模式以邻接法构建系统发育树（NJ树）。如图 2所示，本研究所测的截获蝇类样本与粗野粉蝇最先聚在一起，置信度高达100%，参照样本与伪粗野粉蝇聚成一支，置信度高达100%，粉蝇属的蝇类聚成一支；丽蝇科的蝇类聚成一支。据此判断截获蝇类为粗野粉蝇，与伪粗野粉蝇同属。

2.3 粗野粉蝇与伪粗野粉蝇形态学及生物学比较

对粗野粉蝇和伪粗野粉蝇的成虫在外部形态与分布进行比较，其结果见表 2、图 3；相较于形态上两者的细微差异，DNA条形码法可鉴别粗野粉蝇和伪粗野粉蝇。

2.4 粗野粉蝇形态特征描述

查阅文献发现，本次截获的粗野粉蝇，曾在上海、南京等口岸有截获记录，但在国内并无分布，在欧洲为最常见蝇类之一^[14-15]。目前对其形态鉴定缺乏相关的中文资料，为方便检验检疫工作人员在实际工作中鉴别粗野粉蝇，通过查阅参考文献^{[8, 13]}，将其外部形态描述如下。

头部：雄性复眼为接眼式，雌性复眼裸；额明显向前突出，额宽约为头宽的0.4倍，间额约为一侧额的2.5倍；间额黑色，被细小黑毛；侧额有红棕色粉被和黑色硬毛，额鬃9，侧额鬃2；单眼鬃1，强大；外顶鬃、内顶鬃和前顶鬃强大；后顶鬃弱小；眼后鬃1行；侧颜黑色，有红棕色粉被和黑色硬毛（比侧额的硬毛细小），侧颜宽约为触角第3节宽的2.5倍；新月片、触角第1节、第2节深褐色；触角第2节末端橙红色；触角第3节密布红棕色粉被；触角芒黑色，长羽状；中颜板黑色，有淡色粉被，在两触角间有明显的脊状隆起；髭位于口上片上方，相对口缘鬃强大；下颚须黑色，稍向上弯曲，端部增粗；颊黑色，有红棕色粉被，上半部被黑色细毛，下半部被棕色细毛；颊高约等于眼高；后头平，有淡色粉被和棕色细毛。

胸部：胸底色黑色，具淡色粉被，侧面和背面覆盖棕色长纤毛和较短的黑色纤毛。背中鬃2+3；中鬃2+3；翅内鬃1+2；翅上鬃3；翅前鬃和沟前鬃存在；肩鬃3；肩后鬃1：1；小盾缘鬃3，小盾亚端鬃缺如；心鬃1；后中侧片鬃4；腹侧片鬃1：1；前胸侧板中央凹陷处裸。

翅：翅透明；翅肩鳞黑色，密布硬毛；前缘基鳞棕色；亚前缘骨片棕色；2R5室开放；m1+2呈角形；翅腹面肩横脉与亚缘脉结节裸；径脉结节有几根细毛；下腋瓣表面裸，淡棕色。

腹部：短卵形，黑色，具淡灰色粉被，有暗色中央线；第1和第2腹板外露，第1腹板具黄色细毛，第2腹板前缘和两侧具黄色细毛，中间和末端有鬃毛且具黑色细毛；第3和第4背板在中央线两侧有密封的椭圆形或圆形斑，有缘鬃；第3和第4腹板末端有1对缘鬃；第6背板相当长。第6腹节气门的连线将第6背板均分为前后半部；第7背板长，两侧骨化部分强，较透明区域小；第8腹板和第8背板之间的膜至少在基半部无细毛；雄性腹侧面和腹背面上覆盖直立、浓密而端部细卷的黑毛。

足：黑色；前足胫节有1～2个后腹鬃；中足胫节有2～4个前背鬃；中足和后足股节具黑色粉被，或有黄色毛；雄性后足胫节在前腹鬃周围有许多直立的长纤毛。

生殖器：肛尾叶长，端部增粗，基部1/3裸，背面观端部分叉；侧尾叶背面观直，内侧下半部有短纤毛；侧阳体弓型弯曲，往端部变细，骨化强；侧阳体端部弯曲尖细，一半膜化，骨化处有一排小的齿；侧阳体与基阳体交接处夹角侧面观为角型；下阳体腹突膜状，中央硬化部分狭细，端部尖细且向下弯曲；端阳体膜状，末端钝平而扩大；精囊椭圆形，短小；雌性受精囊长，呈螺旋弯曲。

3 讨论

粗野粉蝇为国内未见分布种^[14-15]。国外有文献报道，粗野粉蝇的大量聚集存在病原体传播的潜在风险^[16]。对蝇类成虫种类的鉴定，传统的形态学方法要求个体外部形态完整，为使鉴定结果更加准确，需对其雄性生殖器进行解剖后鉴定，雌性蝇类的分类与鉴定很困难^[17]，且由于资料缺乏，需要掌握复杂的生殖器解剖技巧，对操作人员操作技能要求较高。本研究对截获的蝇类利用DNA条形码检测技术鉴定为粗野粉蝇，通过查阅国外有关粗野粉蝇形态描述的文献进一步确定该种为粗野粉蝇。将DNA条形码与传统形态学鉴定相结合，可更准确地对外来物种进行种类鉴定，应用在口岸日常的检验检疫工作，可实现对雌性蝇类，尤其是输入性种类的快速准确鉴定。