随着科学与技术的发展，自动化处理逐渐在实验室的常规工作中得以应用^[1]。自动化设备减轻科研人员的工作量，利于科研设计和总结。在制药行业、微生物实验室、食品生产行业以及新一代基因组重测序领域自动化技术已经成为发展方向^{[2, 3]}。与传统的手工方式比较，自动化处理设备的应用可提高工作效率，大大减少人工操作产生的误差。

菌种是从事医学微生物研究的基本材料，菌种的保藏是关键。菌种保藏是根据微生物的生理和生物特点抑制微生物生长繁殖，包括菌种的复苏、传代和保存，即采用最合适的保存方法，最大限度地减少菌种的变异和死亡。保藏方法主要包括定期移植法、液体石蜡保藏法、沙土管保藏法、真空冷冻干燥保藏法、冷冻保藏法和固定化技术保存法^[4]，各有利弊，可适应不同的菌种和操作。菌种保藏中主要使用冷冻保藏法（通常为-80 ℃），其保藏菌种时间长、菌种不易发生变异、操作相对简单。但真空冷冻干燥保藏法保藏的菌种需间隔一定时间（通常为3～5年）进行复苏、传代并保存，以保证菌种存活率。传统的流程需大量的人力和时间。为简化菌种保藏流程，将自动化液体处理器整合到菌种复苏和保藏工作中，提高了工作效率。

96管上旋2-D 编码冷藏架（含96个2 ml的2-D编码冷藏管（Thermo，货号：145047553）；酵母抽提物（Yeast extract，Oxoid，货号：LP0021）；胰蛋白胨（Peptone，Oxoid，货号：LP0042）；丢弃型机械手枪头（RoboRack MDT 235，PerkinElmer，货号：6001295）；自动液体处理器（Janus，PerkinElmer）；96位2-D管开盖器（Thermo，4111NUN-IS）；96孔板离心机（Sigma，3-16PK）。

配制低温菌种保藏液（酵母抽提物0.5%，胰蛋白胨1%，NaCl 0.5%，甘油30% ），高压蒸汽灭菌。使用自动液体处理器于96管上旋2-D编码冷藏架的各冷藏管中加入1 ml菌种保藏液。

于-80 ℃冰箱中取出，保存于96管上旋2-D编码冷藏架的保藏管中的菌种，置室温融化，600×g离心2 min，甩去表面冷凝水。

使用自动液体处理器，采用从96孔板到96孔板的复制程序，于每个原始保存管中移取0.5 ml或1 ml原始菌种保存液至含有1 ml低温菌种保存液的96管上旋2-D 编码冷藏架的保藏管，使用自动液体处理器集成的混匀器混匀，使用旋盖器封盖。

将含有混合后菌液的96管上旋2-D 编码冷藏架置于37 ℃振荡培养箱，200 r/min振荡培养8 h。培养结束后，600×g离心2 min，使保藏液集中于保藏管中下部。

选取1个含有细菌的96管上旋2-D编码冷藏架，使用丢弃型机械手枪头的自动液体处理器，分别从每个含有保藏细菌的2-D冷藏管中吸取0.5和1 ml的菌液加入含有1 ml新鲜保存液的2-D冷藏管中并混匀。将2-D编码冷藏架置于37 ℃振荡培养箱，200 r/min振荡培养8 h。培养结束后，将2个含有新培养菌液的96管上旋2-D 编码冷藏架上的保藏管分别接种于琼脂板培养基，所有菌种均成功复苏。从2个冷藏架上分别选取编号相同的10个保藏管，比较浊度，结果显示，加入1 ml原始菌液的新培养菌液的浊度与加入0.5 ml原始菌液的新培养菌液的浊度相似，提示两者含有细菌的量相当。

大量的细菌复苏和传代应注意避免不同样品交叉污染，主要为菌液与新鲜保藏液混匀的过程，因该过程多次混匀操作，速度及体积控制不当或受冷藏架的空间限制，极易在混合过程中发生样品飞溅导致样品间交叉污染。因此，需比较不同条件下交叉污染的状况。在含有96个2-D管的板架中，相邻列的所有孔中分别加入含有细菌和不含有细菌的培养液，不同方法混匀后，利用PCR检测该细菌的recA基因，判断交叉污染率。结果显示，气动活塞移动速度、机械手枪头及液面的距离、单次混匀菌液的体积均与细菌之间的污染率有直接关系。通过固定2个参数，改变第3个参数，发现当气动活塞移动速度低于全速的20%、机械手枪头插入液面的深度为-2 mm、单次混匀菌液的体积＜100 μl时，不同细菌样品之间的污染率最低，见表 1。

表 1 自动液体处理器不同工作参数与细菌交叉污染率之间的关系

表选项

菌（毒）种的保藏为临床检验及科研型实验室工作的关键。细菌的表型实验或通过高通量、自动化核酸提取和纯化用于下游的分子生物学及测序实验^[5]均与原始菌（毒）种密切相关。国际上开展细菌研究的参比实验室因保藏大量的菌（毒）种开始建立半自动化的流程^[6]。在医院的检验实验室和各种“生物样品库”中，样品处理和保存的自动化处理水平不断提高^{[7, 8]}。但传统的研究型微生物实验室（如疾病预防控制系统），较少应用自动化处理系统，多采用传统方法。近年来，随着对细菌和病毒性疾病监测工作的重视，需分离病原体进行诊断，大量分离菌种需保藏从而研究病原体、变异和疾病的流行趋势。由于低温（-80 ℃）保藏具有稳定性，占用空间小等特点，广泛应用于科研型实验室，但需固定的时间进行细菌传代以保证复苏率，耗费大量的人力和时间，逐渐不适应当前的工作需求。自动液体处理器的出现解决了该问题。此外，利用管底激光蚀刻技术进行标记的2-D保藏管取代了传统记号笔或标签纸标记方法，使自动化处理成为可能。鉴于以上需求和技术手段的进步，需建立半自动化的体系以提高工作效率。

对于菌（毒）种的复苏、传代和保藏应避免菌（毒）种之间的交叉污染。不同样品之间污染的主要来源是菌液的飞溅，多发生于菌液与新鲜保藏液的混匀过程中。因此，构建该复苏、传代体系，通过比较气动活塞的移动速度、每次混匀菌液的体积以及可丢弃型机械手枪头与保藏液面之间的距离等因素对细菌样品之间交叉污染率的影响。结果显示，自动液体处理器上的气动活塞移动的速度越快、每次混匀菌液的体积越大、可丢弃型机械手枪头与保藏液的距离为正数（可丢弃型机械手枪头在混匀保藏液面之下，距离为负数；可丢弃型机械手枪头在混匀保藏液面之上，距离为正数），导致交叉污染率升高；反之，交叉污染率则降低。自动液体处理器上的气动活塞移动的速度越快，形成的冲击气流就越大，产生飞溅液体的可能性就越大；每次混匀菌液的液体体积越大，形成的冲击混合液体的体积就越大，产生飞溅液体的可能性也就增加；而可丢弃型机械手枪头在混匀保藏液体的时候若在液面之上（机械手枪头月液面的距离为正数），则容易形成液体飞溅，受96管上旋2-D管架的空间限制，形成的飞溅液体易从目标样品孔中扩散到相邻的样品孔中，导致交叉污染。

除此之外，复苏率也是菌（毒）种复苏、传代过程中的重要指标。通过比较原始保藏菌液与新鲜保藏液的比例对细菌复苏率的影响，发现原始菌液与新鲜保藏液的比为1∶2或1∶1时，细菌的复苏率为100%，可能与原始保藏菌液仅保藏2年有关。较短的时间内，原始保藏菌液中的活菌数量较多，易复苏。长期保藏对细菌复苏率的影响值得进一步研究。

尽管本实验所建立的工作体系具有较好复苏率和较低的交叉污染率，但该体系涉及单个菌落的分离以及菌种的复验，不可避免地将原始保藏菌液中的污染物带入新的培养物中；同时，本体系使用的2-D编码保藏管较常规冻存管的成本高2～3倍，而配套使用的96位螺旋开盖器的价格也较高，增加了使用成本。

综上所述，本实验建立的高通量半自动化的细菌传代工作体系，通过优化工作参数，可整合到传统的菌种复苏传代工作流程中；最大程度地避免产生菌（毒）种之间交叉污染，具有较高的菌（毒）种复苏率。与传统方法相比，该体系可提高工作效率，节约时间，虽成本较高且存在菌种未进行再纯化等缺陷，但对菌种保藏中心改进和提高工作效率仍有参考价值。