中国媒介生物学及控制杂志  2016, Vol. 27 Issue (3): 283-287

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文章信息

沈睿娟, 毛羽, 谭丰, 杨邦祝, 李艳, 徐作军, 舒莎
SHEN Rui-juan, MAO Yu, TAN Feng, YANG Bang-zhu, LI Yan, XU Zuo-jun, SHU Sha
TQ纯天然植物蚊虫驱避剂质量控制及药效学研究
Study on the quality control and repellent efficacy of TQ natural plant mosquito repellent
中国媒介生物学及控制杂志, 2016, 27(3): 283-287
Chin J Vector Biol & Control, 2016, 27(3): 283-287
10.11853/j.issn.1003.8280.2016.03.017

文章历史

收稿日期: 2016-01-13
网络出版时间: 2016-04-14 12:00
TQ纯天然植物蚊虫驱避剂质量控制及药效学研究
沈睿娟, 毛羽, 谭丰, 杨邦祝, 李艳, 徐作军, 舒莎     
西南民族大学, 四川 成都 610041
摘要: 目的 建立高效无毒TQ纯天然植物蚊虫驱避剂的质量控制标准,研究TQ纯天然植物蚊虫驱避剂的驱蚊效果。 方法 选用川芎、姜黄、羌活、蛇床子、桉叶、薄荷6种药材的挥发油复方制备TQ纯天然植物蚊虫驱避剂,采用薄层色谱法对制剂中的6种成分进行定性鉴别;采用高效液相色谱法测定制剂中的藁本内酯含量;采用气相色谱法测定制剂中的薄荷脑含量;根据国标研究TQ纯天然植物蚊虫驱避剂的驱蚊作用。 结果 薄层色谱法可鉴别6种成分,斑点清晰,分离度好;高效液相色谱法测定藁本内酯,在1.08~6.48 μg范围呈现良好的线性关系(r=0.999 6),平均回收率为99.12%,TQ蚊虫驱避剂含藁本内酯≥19.80 mg/ml;气相色谱法测定薄荷脑,在0.175~0.875 μg范围呈现良好的线性关系(r=0.999),平均回收率为99.95%,TQ蚊虫驱避剂含薄荷脑不得少于6.10 mg/ml;白纹伊蚊攻击力实验合格,TQ纯天然植物蚊虫驱避剂有效保护时间 > 6 h。 结论 制定的驱避剂质量标准操作简便易行、准确可靠、灵敏度高、重现性好,可作为TQ纯天然植物蚊虫驱避剂的质量控制方法。TQ纯天然植物蚊虫驱避剂有效保护时间 > 6 h,达国家驱避剂登记的A级标准。
关键词: 植物挥发油     驱避剂     蚊虫     藁本内酯    
Study on the quality control and repellent efficacy of TQ natural plant mosquito repellent
SHEN Rui-juan, MAO Yu, TAN Feng, YANG Bang-zhu, LI Yan, XU Zuo-jun, SHU Sha     
Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
Abstract: Objective To establish the quality standard of TQ natural plant mosquito repellent, and study its efficacy. Methods Volatile oil of Chuanxiong, turmeric, Notopterygium, Cnidium, eucalyptus and peppermint were used to prepare TQ natural plant mosquito repellent. Volatile oil of Turmeric, Ligusticum chuanxiong Hort, peppermint, eucalyptus and Notopterygium in TQ natural plant mosquito repellent were identified by TLC. A HPLC method to detect ligustilide was established. And the content of menthol was determined by GC. GB/T 13917.10-2009 are adopted to study TQ natural plant mosquito repellent's effect. Results The TLC spots of Volatile oil from Turmeric, Ligusticum chuanxiong Hort, peppermint, eucalyptus and Notopterygium were clear with good separation. The linear ranges of ligustilide was 1.08-6.48 μg, the average recovery rate was 99.12%, content of Ligustilide must not be less than 19.80 mg/ml; The linear ranges of menthol was 0.175-0.875 μg, the average recovery rate was 99.95%, content of menthol must not be less than 6.10 mg/ml. Test standard was met by Aedes albopictus challenge test, TQ biological repellents protect longer than 6 h. Conclusion The quality standards are simple but accurate, which can be used to control the quality of TQ natural biological repellents. TQ natural plant mosquito repellent sprays has obvious repellent effect, and can protect human from mosquitos for more than 6 h, reaching the A level of the national standard.
Key words: Plant volatile oil     Repellents     Mosquitos     Ligustilide    

疟疾和登革热等80多种疾病经蚊虫传播,威胁人类健康[1-2]。目前,避蚊胺(DEET)和驱蚊酯(BAAPE)为最常用的广谱驱避剂,使用过量有一定毒副作用[3-7]。近年来,部分天然植物驱避剂以低毒或无毒,气味清新,使用后不产生灼热感、无残留,易降解、无污染等优点,引起国内外对植物驱避剂研究的广泛重视[8-11]。纯植物精油制备驱避制剂的报道较少,多数驱避剂制剂仍以DEET为主药进行复方制剂。有报道以纯植物精油复方制备驱避剂驱蚊时间较短,约4 h左右[12]。研究发现伞形科植物对蚊虫有较好的驱避效果[13]。川芎、姜黄[14]、羌活、蛇床子、桉叶[15]、薄荷[16-18]6种药材的挥发油均具有一定的驱蚊效果,单独使用驱蚊时间较短,驱避率较低[12]。本研究提取川芎、姜黄、羌活、蛇床子、桉叶、薄荷6种植物精油,复方配制后通过实验筛选,优选有效的复方,拟制备高效、无毒的纯天然植物精油驱避喷雾制剂,并对TQ纯天然植物蚊虫驱避剂进行质量控制[19-21]及药效学研究[22]

1 材料与方法 1.1 仪器与试虫 1.1.1 仪器

岛津GC-14B气相色谱仪;Waters 2695型液相色谱仪;ZF-I三用紫外分析仪;KQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司),AE240电子分析天平(Mettler?Toledo公司),Toppette单道手动可调移液器(大龙医疗设备有限公司),蚊笼(40 cm×30 cm×30 cm),微量进样器。

1.1.2 试药

甲醇(色谱级)、水(为新鲜双蒸水);其他试剂均为分析纯;藁本内酯对照品(自制);薄荷脑对照品、桉油精对照品(中国药品生物制品检定所)。

1.1.3 供试昆虫

白纹伊蚊(Aedes albopictus,♀♀),四川省疾病预防控制中心提供。

1.2 方法 1.2.1 薄层色谱定性鉴别[23] 1.2.1.1 姜黄挥发油的薄层鉴别

取样液配制为10%的乙醇溶液,作为供试品溶液。另取不含姜黄挥发油的阴性样品,加无水乙醇配制成5%的乙醇溶液,作为阴性对照液。取姜黄挥发油,加无水乙醇配制为5%的姜黄挥发油溶液,作对照药材溶液。参照薄层色谱法实验,吸取上述3种溶液,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯(5.0:3.0:0.3)为展开剂,展开、取出、晾干,喷以1%香草醛硫酸溶液,85 ℃烘4 min,放置4 min后日光下检视。

1.2.1.2 川芎挥发油的鉴别

取样液加无水乙醇配制成10%的乙醇溶液,作为供试品溶液。取不含川芎挥发油的阴性样品,加无水乙醇配制成5%的乙醇溶液,作为阴性对照液。取藁本内酯对照品,加无水乙醇配制成25 mg/ml的溶液,作藁本内酯对照液。参照薄层色谱法实验,吸取上述3种溶液,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯(5.0:2.0:0.5)为展开剂,展开、取出、晾干,在紫外灯(254 nm)下检视。

1.2.1.3 羌活、蛇床子挥发油的鉴别

取样液加无水乙醇配制成10%的乙醇溶液,作为供试品溶液。取不含蛇床子挥发油和不含羌活挥发油的阴性样品,加无水乙醇配制成5%的乙醇溶液,作为阴性对照液。取蛇床子挥发油和羌活挥发油,分别加无水乙醇配制成5%的挥发油溶液,制蛇床子挥发油和羌活挥发油溶液。按照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)实验,吸取上述3种溶液,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯(6.0:1.5:0.6)为展开剂,展开、取出、晾干,于紫外灯(254 nm)下检视;喷1%香草醛硫酸溶液,在85 ℃烘4 min,日光下检视。

1.2.1.4 桉叶油、薄荷油的鉴别

取样液加无水乙醇配制成10%的乙醇溶液,作为供试品溶液。取不含薄荷油和不含桉叶油的阴性样品,加无水乙醇配制成5%的乙醇溶液,作为阴性对照液。取薄荷脑对照品,加无水乙醇配制成25 mg/ml的溶液,制成薄荷脑对照品溶液。取桉油精对照品,加无水乙醇配制成25 mg/ml的溶液,制成桉油精对照品溶液。按照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)实验,吸取上述3种溶液,分别点于同一硅胶GF254薄层板上,以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯(7:2:0.6)为展开剂,展开、取出、晾干,在紫外灯(254 nm)下检视;喷1%香草醛硫酸溶液,在85 ℃烘4 min,日光下检视。

1.2.2 高效液相色谱(HPLC)法测定藁本内酯含量 [24-25] 1.2.2.1 色谱条件

色谱柱为Phenomenex C18 (4.6 mm×250 mm×5 μm);流动相为甲醇:水=60:40;流速为1 ml/min;检测波长为325 nm。

1.2.2.2 供试品溶液的配制

精密吸取TQ纯天然植物蚊虫驱避剂样品1 ml,用色谱甲醇定容于50 ml容量瓶中,过0.45 μm微孔滤膜即得。

1.2.2.3 对照品溶液的配制

精确称取3.6 mg藁本内酯,加甲醇溶解,摇匀,制成0.36 mg/ml的标准溶液,过0.45 μm微孔滤膜即得。

1.2.2.4 线性关系考察

分别吸取标准溶液3、6、9、12、15、18 μl进样,以峰面积(Y)对进样量(X)进行回归,得标准曲线:Y=961.84X+2.826 7(r=0.999 2)。结果表明藁本内酯对照品进样量在1.08~6.48 μg之间时,进样量与峰面积线性关系良好。

1.2.2.5 精密度实验

精密吸取同一供试品10 μl,重复进样5次,测得峰面积相对标准偏差(RSD)=0.66%(n=5),峰高RSD=1.74%,表明仪器精密度良好。

1.2.2.6 稳定性实验

精密吸取供试品10 μl,分别在0、1、5、9、24 h进样,测得峰面积的RSD=2.41%,峰高RSD=2.05%,表明供试品在24 h内稳定。

1.2.2.7 重现性实验

取同一批号下的5份样品各1 ml,制备5份供试液,按前述色谱条件进行测定,测得制剂中藁本内酯含量RSD=1.31%,说明此方法重现性良好。

1.2.2.8 回收率实验

采用加样回收法,精密称取97.80 mg藁本内酯对照品,用色谱级甲醇定容于10 ml容量瓶中,摇匀,得含量为9.78 mg/ml的对照品溶液。精密量取已知含量样品1 ml,置于50 ml容量瓶中,分别加入含量为9.78 mg/ml的对照品溶液,甲醇定容,制成供试品溶液,精密吸取6份供试品溶液,按前述色谱条件进行测定,测得平均回收率为99.12%,RSD=1.91%(n=6),结果见表 1

表 1 藁本内酯加样回收率实验结果 Table 1 Recovery rate of ligustilide
1.2.2.9 样品含量测定

取3个批号的TQ纯天然植物蚊虫驱避剂样品,制备供试溶液,每批平行3份,进样2次,按上述色谱条件分别测定含量。

1.2.3 GC法测定薄荷脑含量[26-27] 1.2.3.1 色谱条件

DB-1701毛细管色谱柱;程序升温:初始温度60 ℃,保持3 min,以4 ℃/min的速率升温至120 ℃,保持5 min,再以6 ℃/min的速率升温至220 ℃,保持5 min;分流比为40:1;载气为氮气;载气流量为0.1 mPa;进样口温度为260 ℃;检测器温度为260 ℃;内标物为薄荷脑。进样量2 μl,见图 1

图 1 气相色谱图 Figure 1 Gas chromatogram of TQ natural plant mosquito repellent(a)and menthol(b)
1.2.3.2 对照品溶液制备

取薄荷脑对照品适量,加无水乙醇制成3.50 mg/ml 的对照品溶液,即得。

1.2.3.3 内标溶液的配制

取樟脑适量,加无水乙醇制成2.07 mg/ml 的溶液,即得。

1.2.3.4 供试品溶液制备

精密量取样品液25 ml,置于50 ml容量瓶中,用无水乙醇定容至刻度,摇匀。再精密吸取供试品溶液1 ml,置于10 ml容量瓶中,精密加入内标溶液1 ml,加无水乙醇定容至刻度,摇匀,即得。

1.2.3.5 标准曲线绘制

精密量取对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml,分别置于10 ml容量瓶中,加内标溶液1.0 ml,用无水乙醇定容至刻度,配制成混合对照品系列,按上述条件进行测定,以薄荷脑量为横坐标(X),以薄荷脑与内标峰面积比纵坐标(Y),进行线性回归分析,其回归方程为Y=5.318 5X-0.059 7(r=0.999),表明薄荷脑在0.175~0.875 μg范围内线性关系良好。

1.2.3.6 精密度实验

精密吸取对照品溶液1 ml,置于10 ml容量瓶中,精密加入内标溶液1 ml,用无水乙醇定容至刻度,摇匀。并按上述色谱条件测定含量,RSD=2.44%,说明仪器精密度良好。

1.2.3.7 稳定性考察

取同一批样品,按供试品溶液制备方法制成供试品溶液。并按上述色谱条件,分别于配制后0、1、2、4、8 h测定含量,RSD=1.83%,说明样品溶液在8 h内稳定性良好。

1.2.3.8 重复性实验

取同一批号样品,按供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液,并按上述色谱条件测定含量。RSD=1.87%,表明样品重现性良好。

1.2.3.9 回收率实验

采用加样回收法,精密吸取已知薄荷脑含量为6.12 mg/ml的样品,稀释1倍后,吸取6份,每份1 ml,置于10 ml容量瓶中,分别精密加入3.50 g/ml的对照品溶液1.0、1.5、2.0 ml,溶液1 ml,无水乙醇定容,摇匀,进样10 μl,测得平均回收率为99.95%,RSD=1.34%(n=6),见表 2

表 2 薄荷脑加样回收率实验结果 Table 2 Recovery rate of menthol
1.2.3.10 含量测定

取3个批号的TQ纯天然植物蚊虫驱避剂样品,制备供试溶液,每批平行3份,进样2次,按上述色谱条件分别测定含量。

1.2.4 药效学评价[28] 1.2.4.1 攻击力实验[29-30]

温度(26±1)℃,相对湿度(60±5)%的条件下,在蚊笼内放入300只羽化后4~5 d未吸血雌性白纹伊蚊成虫,选择3人在其手背暴露4 cm×4 cm皮肤,其余部分用乳胶手套严密遮蔽。将手伸入蚊笼放置2 min,前来停落的试虫>30只为攻击力实验合格,此人及此笼白纹伊蚊可用于驱避实验。

1.2.4.2 驱避实验

采用GB/T 13917.10-2009《农药登记用卫生杀虫剂室内药效试验及评价 第10部分:模拟现场》研究TQ纯天然植物蚊虫驱避剂的驱蚊作用。在白纹伊蚊攻击力实验合格的3人双手手背上各画出5 cm×5 cm的皮肤面积,其中一只手为空白对照,另一只手按1.5 μl/cm2的剂量均匀涂抹待测的TQ纯天然植物蚊虫驱避剂37 μl,暴露其中的4 cm×4 cm皮肤,严密遮蔽其余部分。涂抹驱避剂后2 h,将手伸入白纹伊蚊攻击力实验合格的蚊笼中2 min,观察有无蚊虫前来停落吸血。以后测试1次/h,实验组只要有1只蚊虫前来停落吸血即判别为驱避剂失效,实验停止。记录驱避剂的有效保护时间(h)。

2 结 果 2.1 薄层色谱(TLC)定性鉴别

在薄层色谱上,显色后6种供试品成分和对照品在相同的位置上显示相同颜色斑点。阴性对照显色后无相应的斑点,说明阴性样品无干扰,见图 2

图 2 6种主成分薄层色谱图 Figure 2 Thin layer chromatogram of six volatile oil
2.2 HPLC法测定藁本内酯含量

HPLC法测定TQ蚊虫驱避剂中藁本内酯在1.08~6.48 μg范围呈现良好的线性关系(r=0.999 6),平均回收率为99.12%,喷雾剂中藁本内酯的含量分别为19.89、19.81和19.87 mg/ml,平均值为19.85 mg/ml。故本品含藁本内酯≥19.80 mg/ml。

2.3 GC法测定薄荷脑含量

气相色谱法测定TQ蚊虫驱避剂中薄荷脑在0.175~0.875 μg范围呈现良好的线性关系(r=0.999),平均回收率为99.95%,喷雾剂中薄荷脑的含量分别为6.40、6.10 和6.24 mg/ml。平均值为6.28 mg/ml,故本品含薄荷脑不得少于6.10 mg/ml。

2.4 药效学评价

参照国标GB/T 13917.10-2009中的方法测定TQ纯天然植物蚊虫驱避剂的驱蚊作用。TQ纯天然植物蚊虫驱避剂对白纹伊蚊驱避时长>6 h,结果见表 3

表 3 TQ纯天然植物蚊虫驱避剂药效结果 Table 3 TQ natural plant mosquito repellent’s efficacy experiment results
3 讨 论

川芎油、羌活油和蛇床子油从伞形科植物川芎、羌活和蛇床子中提取,姜黄油从姜科植物姜黄中提取,桉叶油从桃金娘科植物桉叶中提取,薄荷油从唇形科植物薄荷中提取,几类植物均为我国常见中药材,资源丰富,价格经济,由川芎油、姜黄油、羌活油、蛇床子油、桉叶油、薄荷油复方配制的TQ纯天然植物蚊虫驱避剂对白纹伊蚊有很好的驱避作用,说明其有开发成纯天然植物蚊虫驱避剂的广阔前景。

薄层色谱实验结果表明,采用TLC法对姜黄、川芎、薄荷、桉叶和羌活等药材进行薄层色谱鉴别,反复操作多次,均能检测出药材的特征斑点,且阴性样品无干扰,说明本方法具有良好的专属性和重现性,且省时省力,操作简便,值得应用。

本实验在多次预实验的基础上,建立HPLC法测定藁本内酯含量,气相色谱法测定薄荷脑含量的分析方法,并对这两种方法分别进行详细的方法学考察,证明该含量测定方法具有稳定性、专属性,且灵敏度高,可有效控制藁本内酯和薄荷脑质量,为制剂的质量控制提供科学依据。

刘辉等[12]曾经对植物精油进行复方配制,发现复方精油驱避活性大于单种精油,但驱避时长仅有4 h。本文根据国标GB/T 13917.10-2009研究TQ纯天然植物蚊虫驱避剂的驱蚊作用,其驱避时长>6 h,达国家A级标准,说明适当调整成分和比例可延长驱避时间。复方配制的植物精油在蚊虫控制方面有一定开发潜力,值得深入研究。

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