疟疾和登革热等80多种疾病经蚊虫传播，威胁人类健康^[1-2]。目前，避蚊胺（DEET）和驱蚊酯（BAAPE）为最常用的广谱驱避剂，使用过量有一定毒副作用^[3-7]。近年来，部分天然植物驱避剂以低毒或无毒，气味清新，使用后不产生灼热感、无残留，易降解、无污染等优点，引起国内外对植物驱避剂研究的广泛重视^[8-11]。纯植物精油制备驱避制剂的报道较少，多数驱避剂制剂仍以DEET为主药进行复方制剂。有报道以纯植物精油复方制备驱避剂驱蚊时间较短，约4 h左右^[12]。研究发现伞形科植物对蚊虫有较好的驱避效果^[13]。川芎、姜黄^[14]、羌活、蛇床子、桉叶^[15]、薄荷^[16-18]6种药材的挥发油均具有一定的驱蚊效果，单独使用驱蚊时间较短，驱避率较低^[12]。本研究提取川芎、姜黄、羌活、蛇床子、桉叶、薄荷6种植物精油，复方配制后通过实验筛选，优选有效的复方，拟制备高效、无毒的纯天然植物精油驱避喷雾制剂，并对TQ纯天然植物蚊虫驱避剂进行质量控制^[19-21]及药效学研究^[22]。

1 材料与方法 1.1 仪器与试虫 1.1.1 仪器

岛津GC-14B气相色谱仪；Waters 2695型液相色谱仪；ZF-I三用紫外分析仪；KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司），AE240电子分析天平（Mettler?Toledo公司），Toppette单道手动可调移液器（大龙医疗设备有限公司），蚊笼（40 cm×30 cm×30 cm），微量进样器。

1.1.2 试药

甲醇（色谱级）、水（为新鲜双蒸水）；其他试剂均为分析纯；藁本内酯对照品（自制）；薄荷脑对照品、桉油精对照品（中国药品生物制品检定所）。

1.1.3 供试昆虫

白纹伊蚊（Aedes albopictus，♀♀），四川省疾病预防控制中心提供。

1.2 方法 1.2.1 薄层色谱定性鉴别^[23] 1.2.1.1 姜黄挥发油的薄层鉴别

取样液配制为10%的乙醇溶液，作为供试品溶液。另取不含姜黄挥发油的阴性样品，加无水乙醇配制成5%的乙醇溶液，作为阴性对照液。取姜黄挥发油，加无水乙醇配制为5%的姜黄挥发油溶液，作对照药材溶液。参照薄层色谱法实验，吸取上述3种溶液，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯（5.0:3.0:0.3）为展开剂，展开、取出、晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，85 ℃烘4 min，放置4 min后日光下检视。

1.2.1.2 川芎挥发油的鉴别

取样液加无水乙醇配制成10%的乙醇溶液，作为供试品溶液。取不含川芎挥发油的阴性样品，加无水乙醇配制成5%的乙醇溶液，作为阴性对照液。取藁本内酯对照品，加无水乙醇配制成25 mg/ml的溶液，作藁本内酯对照液。参照薄层色谱法实验，吸取上述3种溶液，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯（5.0:2.0:0.5）为展开剂，展开、取出、晾干，在紫外灯（254 nm）下检视。

1.2.1.3 羌活、蛇床子挥发油的鉴别

取样液加无水乙醇配制成10%的乙醇溶液，作为供试品溶液。取不含蛇床子挥发油和不含羌活挥发油的阴性样品，加无水乙醇配制成5%的乙醇溶液，作为阴性对照液。取蛇床子挥发油和羌活挥发油，分别加无水乙醇配制成5%的挥发油溶液，制蛇床子挥发油和羌活挥发油溶液。按照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录ⅥB）实验，吸取上述3种溶液，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯（6.0:1.5:0.6）为展开剂，展开、取出、晾干，于紫外灯（254 nm）下检视；喷1%香草醛硫酸溶液，在85 ℃烘4 min，日光下检视。

1.2.1.4 桉叶油、薄荷油的鉴别

取样液加无水乙醇配制成10%的乙醇溶液，作为供试品溶液。取不含薄荷油和不含桉叶油的阴性样品，加无水乙醇配制成5%的乙醇溶液，作为阴性对照液。取薄荷脑对照品，加无水乙醇配制成25 mg/ml的溶液，制成薄荷脑对照品溶液。取桉油精对照品，加无水乙醇配制成25 mg/ml的溶液，制成桉油精对照品溶液。按照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录ⅥB）实验，吸取上述3种溶液，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯（7:2:0.6）为展开剂，展开、取出、晾干，在紫外灯（254 nm）下检视；喷1%香草醛硫酸溶液，在85 ℃烘4 min，日光下检视。

1.2.2 高效液相色谱（HPLC）法测定藁本内酯含量 ^[24-25] 1.2.2.1 色谱条件

色谱柱为Phenomenex C₁₈ （4.6 mm×250 mm×5 μm）；流动相为甲醇:水=60:40；流速为1 ml/min；检测波长为325 nm。

1.2.2.2 供试品溶液的配制

精密吸取TQ纯天然植物蚊虫驱避剂样品1 ml，用色谱甲醇定容于50 ml容量瓶中，过0.45 μm微孔滤膜即得。

1.2.2.3 对照品溶液的配制

精确称取3.6 mg藁本内酯，加甲醇溶解，摇匀，制成0.36 mg/ml的标准溶液，过0.45 μm微孔滤膜即得。

1.2.2.4 线性关系考察

分别吸取标准溶液3、6、9、12、15、18 μl进样，以峰面积（Y）对进样量（X）进行回归，得标准曲线：Y=961.84X+2.826 7（r=0.999 2）。结果表明藁本内酯对照品进样量在1.08～6.48 μg之间时，进样量与峰面积线性关系良好。

1.2.2.5 精密度实验

精密吸取同一供试品10 μl，重复进样5次，测得峰面积相对标准偏差（RSD）=0.66%（n=5），峰高RSD=1.74%，表明仪器精密度良好。

1.2.2.6 稳定性实验

精密吸取供试品10 μl，分别在0、1、5、9、24 h进样，测得峰面积的RSD=2.41%，峰高RSD=2.05%，表明供试品在24 h内稳定。

1.2.2.7 重现性实验

取同一批号下的5份样品各1 ml，制备5份供试液，按前述色谱条件进行测定，测得制剂中藁本内酯含量RSD=1.31%，说明此方法重现性良好。

1.2.2.8 回收率实验

采用加样回收法，精密称取97.80 mg藁本内酯对照品，用色谱级甲醇定容于10 ml容量瓶中，摇匀，得含量为9.78 mg/ml的对照品溶液。精密量取已知含量样品1 ml，置于50 ml容量瓶中，分别加入含量为9.78 mg/ml的对照品溶液，甲醇定容，制成供试品溶液，精密吸取6份供试品溶液，按前述色谱条件进行测定，测得平均回收率为99.12%，RSD=1.91%（n=6），结果见表 1。

1.2.2.9 样品含量测定

取3个批号的TQ纯天然植物蚊虫驱避剂样品，制备供试溶液，每批平行3份，进样2次，按上述色谱条件分别测定含量。

1.2.3 GC法测定薄荷脑含量^[26-27] 1.2.3.1 色谱条件

DB-1701毛细管色谱柱；程序升温：初始温度60 ℃，保持3 min，以4 ℃/min的速率升温至120 ℃，保持5 min，再以6 ℃/min的速率升温至220 ℃，保持5 min；分流比为40:1；载气为氮气；载气流量为0.1 mPa；进样口温度为260 ℃；检测器温度为260 ℃；内标物为薄荷脑。进样量2 μl，见图 1。

1.2.3.2 对照品溶液制备

取薄荷脑对照品适量，加无水乙醇制成3.50 mg/ml 的对照品溶液，即得。

1.2.3.3 内标溶液的配制

取樟脑适量，加无水乙醇制成2.07 mg/ml 的溶液，即得。

1.2.3.4 供试品溶液制备

精密量取样品液25 ml，置于50 ml容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，摇匀。再精密吸取供试品溶液1 ml，置于10 ml容量瓶中，精密加入内标溶液1 ml，加无水乙醇定容至刻度，摇匀，即得。

1.2.3.5 标准曲线绘制

精密量取对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml，分别置于10 ml容量瓶中，加内标溶液1.0 ml，用无水乙醇定容至刻度，配制成混合对照品系列，按上述条件进行测定，以薄荷脑量为横坐标（X），以薄荷脑与内标峰面积比纵坐标（Y），进行线性回归分析，其回归方程为Y=5.318 5X-0.059 7（r=0.999），表明薄荷脑在0.175～0.875 μg范围内线性关系良好。

1.2.3.6 精密度实验

精密吸取对照品溶液1 ml，置于10 ml容量瓶中，精密加入内标溶液1 ml，用无水乙醇定容至刻度，摇匀。并按上述色谱条件测定含量，RSD=2.44%，说明仪器精密度良好。

1.2.3.7 稳定性考察

取同一批样品，按供试品溶液制备方法制成供试品溶液。并按上述色谱条件，分别于配制后0、1、2、4、8 h测定含量，RSD=1.83%，说明样品溶液在8 h内稳定性良好。

1.2.3.8 重复性实验

取同一批号样品，按供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，并按上述色谱条件测定含量。RSD=1.87%，表明样品重现性良好。

1.2.3.9 回收率实验

采用加样回收法，精密吸取已知薄荷脑含量为6.12 mg/ml的样品，稀释1倍后，吸取6份，每份1 ml，置于10 ml容量瓶中，分别精密加入3.50 g/ml的对照品溶液1.0、1.5、2.0 ml，溶液1 ml，无水乙醇定容，摇匀，进样10 μl，测得平均回收率为99.95%，RSD=1.34%（n=6），见表 2。

1.2.3.10 含量测定

取3个批号的TQ纯天然植物蚊虫驱避剂样品，制备供试溶液，每批平行3份，进样2次，按上述色谱条件分别测定含量。

1.2.4 药效学评价^[28] 1.2.4.1 攻击力实验^[29-30]

温度（26±1）℃，相对湿度（60±5）%的条件下，在蚊笼内放入300只羽化后4～5 d未吸血雌性白纹伊蚊成虫，选择3人在其手背暴露4 cm×4 cm皮肤，其余部分用乳胶手套严密遮蔽。将手伸入蚊笼放置2 min，前来停落的试虫＞30只为攻击力实验合格，此人及此笼白纹伊蚊可用于驱避实验。

1.2.4.2 驱避实验

采用GB/T 13917.10-2009《农药登记用卫生杀虫剂室内药效试验及评价 第10部分：模拟现场》研究TQ纯天然植物蚊虫驱避剂的驱蚊作用。在白纹伊蚊攻击力实验合格的3人双手手背上各画出5 cm×5 cm的皮肤面积，其中一只手为空白对照，另一只手按1.5 μl/cm²的剂量均匀涂抹待测的TQ纯天然植物蚊虫驱避剂37 μl，暴露其中的4 cm×4 cm皮肤，严密遮蔽其余部分。涂抹驱避剂后2 h，将手伸入白纹伊蚊攻击力实验合格的蚊笼中2 min，观察有无蚊虫前来停落吸血。以后测试1次/h，实验组只要有1只蚊虫前来停落吸血即判别为驱避剂失效，实验停止。记录驱避剂的有效保护时间（h）。

2 结 果 2.1 薄层色谱（TLC）定性鉴别

在薄层色谱上，显色后6种供试品成分和对照品在相同的位置上显示相同颜色斑点。阴性对照显色后无相应的斑点，说明阴性样品无干扰，见图 2。

2.2 HPLC法测定藁本内酯含量

HPLC法测定TQ蚊虫驱避剂中藁本内酯在1.08～6.48 μg范围呈现良好的线性关系（r=0.999 6），平均回收率为99.12%，喷雾剂中藁本内酯的含量分别为19.89、19.81和19.87 mg/ml，平均值为19.85 mg/ml。故本品含藁本内酯≥19.80 mg/ml。

2.3 GC法测定薄荷脑含量

气相色谱法测定TQ蚊虫驱避剂中薄荷脑在0.175～0.875 μg范围呈现良好的线性关系（r=0.999），平均回收率为99.95%，喷雾剂中薄荷脑的含量分别为6.40、6.10 和6.24 mg/ml。平均值为6.28 mg/ml，故本品含薄荷脑不得少于6.10 mg/ml。

2.4 药效学评价

参照国标GB/T 13917.10-2009中的方法测定TQ纯天然植物蚊虫驱避剂的驱蚊作用。TQ纯天然植物蚊虫驱避剂对白纹伊蚊驱避时长＞6 h，结果见表 3。

3 讨 论

川芎油、羌活油和蛇床子油从伞形科植物川芎、羌活和蛇床子中提取，姜黄油从姜科植物姜黄中提取，桉叶油从桃金娘科植物桉叶中提取，薄荷油从唇形科植物薄荷中提取，几类植物均为我国常见中药材，资源丰富，价格经济，由川芎油、姜黄油、羌活油、蛇床子油、桉叶油、薄荷油复方配制的TQ纯天然植物蚊虫驱避剂对白纹伊蚊有很好的驱避作用，说明其有开发成纯天然植物蚊虫驱避剂的广阔前景。

薄层色谱实验结果表明，采用TLC法对姜黄、川芎、薄荷、桉叶和羌活等药材进行薄层色谱鉴别，反复操作多次，均能检测出药材的特征斑点，且阴性样品无干扰，说明本方法具有良好的专属性和重现性，且省时省力，操作简便，值得应用。

本实验在多次预实验的基础上，建立HPLC法测定藁本内酯含量，气相色谱法测定薄荷脑含量的分析方法，并对这两种方法分别进行详细的方法学考察，证明该含量测定方法具有稳定性、专属性，且灵敏度高，可有效控制藁本内酯和薄荷脑质量，为制剂的质量控制提供科学依据。

刘辉等^[12]曾经对植物精油进行复方配制，发现复方精油驱避活性大于单种精油，但驱避时长仅有4 h。本文根据国标GB/T 13917.10-2009研究TQ纯天然植物蚊虫驱避剂的驱蚊作用，其驱避时长＞6 h，达国家A级标准，说明适当调整成分和比例可延长驱避时间。复方配制的植物精油在蚊虫控制方面有一定开发潜力，值得深入研究。