南水北调东线山东段于2013年底建成通水，提水地区湖泊气候温暖湿润、地理条件复杂、水系发达，适宜媒介蚊虫孳生繁殖，形成媒介蚊虫种类的多样性。景晓等^[1]曾对山东省的蚊虫种类和分布进行调查，发现山东地区有记载的蚊虫种类有7属41种，伊蚊属(Aedes)、库蚊属(Culex)和按蚊属(Anopheles)的蚊种较多，占蚊种总数的87.70%。其中三带喙库蚊(Cx. tritaeniorhynchus)是流行性乙型脑炎(乙脑)的主要传播媒介。在20世纪50-80年代，山东省曾经发生乙脑大流行。自1986年乙脑疫苗纳入儿童常规免疫后，乙脑流行情况趋于平稳^[2-3]。为防止媒介生物性传染病的输入和流行，山东省对工程蓄水前后媒介生物性传染病尤其是蚊媒传播乙脑开展了大量的监测和监控，为制定通水后干预措施提供重要科学参考。本研究于2015年6-9月对调水沿线的主要监测点进行蚊密度调查及乙脑病毒核酸检测。

2015年6-9月，在山东省南水北调沿线选择微山韩庄、任城太白湖以及泰安东平湖国家或省级监测点采集蚊虫标本。

采用人帐诱法采集蚊虫，将当天采集的蚊虫置养蚊笼带回实验室，置于-20 ℃冰箱中冷冻30 min，蚊虫冻晕后，剔除雄蚊进行分类。蚊虫分类后约50只为1管，立即放入-80 ℃冰箱保存。

将保存在-80 ℃冰箱中蚊虫取出，立即埋入冰盒中。在生物安全柜内将蚊虫标本倒入研磨器中，加1 ml提前预冷好并置于4 ℃的研磨液，研磨至无明显组织块后，移到EP管中4 ℃、12 000×g离心20 min。将离心后的上清液转移到新的EP管中，用于后续检测。

在含有200 μl蚊虫研磨液的EP管中加入800 μl Trizol试剂，轻微振荡，室温静置10 min后使Trizol充分裂解组织。再加入200 μl氯仿，用力振荡至粉红色乳状剂，室温静置5 min，出现分层现象后于4 ℃、12 000×g离心10 min，上清转移到新的EP管，加入与上清液等量的异丙醇，混匀。待有白色沉淀析出时倒掉管中液体，加1 ml现配预冷好置于4 ℃的75%乙醇。吹洗后4 ℃、9 000×g离心10 min。待白色沉淀再次沉淀于管底，倒出上清置空气中干燥。完全干燥后，加15 ml DEPC水，备用。

使用随机引物制备cDNA，将11 μl提取的RNA、1 μl 250 μmol/L Random、1 μl 60 μmol/L Oligo(dT)18加入EP管中混匀，制成RNA-Primer。将上述RNA-Primer 65 ℃水浴10 min，取出后立即置于冰上。再取新EP管加入RNA-Primer 13 μl、5 RT Reaction Buffer 5 μl、25 mmol/L dNTP 1 μl、 25 U/μl RNase Inhibitor 1 μl、 200 U/μl M-MLV RTase 1 μl、ddH₂O(RNase/DNase) 4 μl，使终体系为25 μl，混匀，37 ℃水浴60 min，待用。

使用Tiangen SuperReal PreMix Plus Kit和ABIPRISM Line Gene 9600荧光定量PCR检测系统进行检测。设计上游引物：5′-AGA GCG GGG AAA AAG GTC AT-3′，下游引物：5′-TTT CAC GCT CTT TCT ACA GT-3′。具体方法：取上述提取的蚊虫RNA，根据试剂盒说明书建立实时荧光定量PCR 反应体系。反应条件： 95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40 个循环。由仪器自动设置在每一循环72 ℃采集荧光信号。熔解曲线分析条件为95 ℃ 15 s，70 ℃ 1 min，0.5 ℃/s升温至95 ℃，并收集荧光信号。结果判断：在阴、阳性对照均成立时，如果标本在35个循环前有明显的扩增曲线，则该标本可判定为病毒RNA检测阳性；如果扩增曲线出现在35～40个循环，重复2次，若2次均能检测到，则判定为阳性，否则为阴性；无荧光信号，判定为阴性。

准备若干单层BHK-21细胞生长至70%～80%时的细胞培养管，弃去细胞培养液，加入0.2 ml标本研磨滤过液，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中，每隔15 min轻摇一下，促进吸附，1 h后取出细胞培养管，弃去液体，加入2 ml细胞维持液，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养，每隔24 h观察1次，显微镜下观察到细胞病变时收获，若未出现病变则继续观察。出现可疑病变细胞继续传代培养，未出现病变者盲传3代。

在微山韩庄、任城太白湖以及泰安东平湖监测点共采集蚊虫6属17种16 711只。库蚊属种类最多，有10种，分别为淡色库蚊(Culex pipiens pallens)、二带喙库蚊(Cx. bitaeniorhynchus)、三带喙库蚊(Cx. tritaeniorhynchus)、贪食库蚊(Cx. halifaxii)、褐尾库蚊(Cx. fuscanus)、白胸库蚊(Cx. pallidothorax)、迷走库蚊(Cx. vagans)、霜背库蚊(Cx. whitmorei)、伪杂鳞库蚊(Cx. pseudovishnui)和东方库蚊(Cx. orientalis)。伊蚊属3种，分别为仁川伊蚊(Aedes chemulpoensis)、刺扰伊蚊(Ae. vexans)和白纹伊蚊(Ae. albopictus)；按蚊属1种，为中华按蚊(Anopheles sinensis)；阿蚊属1种，为骚扰阿蚊(Armigeres subalbatus)；轲蚊属1种，为黄色轲蚊(Coquillettidia ochracea)，曼蚊属1种，为常型曼蚊(Mansonia uniformis)。其中三带喙库蚊、淡色库蚊和常型曼蚊分别为6 610只(39.55%)、6 465只(38.69%)和2 357只(14.10%)，其他蚊种所占比例较小；三带喙库蚊和淡色库蚊为优势蚊种。通过人饵帐通宵观察发现，2015年各监测点6月上旬有少量蚊虫出现，以淡色库蚊为主，之后密度不断增高，7月达到峰值；三带喙库蚊、常型曼蚊和中华按蚊8月达到蚊虫密度高峰，之后蚊虫密度开始下降，见表 1。

表 1 山东省南水北调沿线监测点主要蚊虫密度消长数量(只) Table 1 Seasonality of mosquitoes in Taibai Lake, Weishan Lake and Dongping Lake, which situated along the south-to-north water diversion project

表选项

711只成蚊标本，共346组蚊研磨液，进行乙脑病毒的核酸检测，结果见图 1。从31组三带喙库蚊、10组淡色库蚊、1组黄色轲蚊中检出乙脑病毒核酸(表 2)，上述标本经细胞培养未分离出乙脑病毒。

图 1 蚊虫标本乙脑病毒核酸实时荧光定量PCR检测结果 Figure 1 PCR products of JEV nucleic acids of mosquito sample Quantitative Real-time PCR

图选项

表 2 不同蚊种乙脑病毒核酸检测阳性率(%) Table 2 The positive rate of JEV nucleic acids of different mosquito species

表选项

山东省南水北调沿线湖泊水系发达，地理条件复杂，有利于蚊虫孳生，且多为旅游度假区，人口流动性较大，是山东省蚊媒疾病的高发区^[4-6]。因此，做好蚊类监测以及病毒携带情况研究具有重要公共卫生意义，同时为南水北调工程对湖区相关影响的研究提供基础资料。

本研究选择3个采集点在一定程度上反映了山东省南水北调沿线蚊虫的种类分布和密度季节消长情况。从蚊种构成来看，本研究采用人帐监测法共采集到蚊虫6属17种，其中三带喙库蚊稍占优势，与景晓等^[1]对山东省蚊虫的调查结果一致。三带喙库蚊幼虫主要孳生于稻田、池塘、沼泽和湖边等场所，而调水沿线湖泊较多、种植大量水稻，导致监测点以三带喙库蚊为优势蚊种^[7-9]。淡色库蚊出现较早，密度首先达到高峰，但在随后的8月密度高峰为更适宜孳生的三带喙库蚊；同时还捕获到水生植物较多的湿地环境孳生的常型曼蚊和黄色轲蚊。常型曼蚊幼虫喜孳生于荷塘、沼泽、茭白池等，附着于水生植物，以芦苇最为普遍，湿地内有大量芦苇、莲藕等水生植物，故该蚊为湿地主要蚊种之一。

本研究通过分子生物学方法，在山东省南水北调沿线采集的三带喙库蚊、淡色库蚊和黄色轲蚊中检测到乙脑病毒核酸，自然感染率分别为22.96%、7.58%和16.67%。由于三带喙库蚊和淡色库蚊为当地的优势蚊种，提示该地区乙脑病毒感染风险较高，应注意蚊虫防治从而降低乙脑感染风险。本研究采用实时荧光定量PCR，较传统病毒分离的PCR法灵敏度高，可大大提高检出率。近几年，山东省也开展了乙脑病毒自然感染调查^[10]。2008年高晓艳等^[11]于济南市采集的蚊虫标本分离出乙脑病毒。2008、2009年陈维欣^[12]在济南、淄博、烟台、青岛、济宁、菏泽和东营市7个采集点采集到5属6种共19 211只蚊虫标本，分242批对蚊虫标本采用半巢式RT-PCR检测乙脑病毒核酸，总阳性率为21.49%(52/242)，其中三带喙库蚊感染最为普遍。2010年6-10月周传玲^[13]对山东省枣庄市乙脑流行情况进行调查，对35批三带喙库蚊、4批中华按蚊和1批二带喙库蚊共40批蚊虫进行RT-PCR扩增，结果三带喙库蚊中检出阳性6批，批次阳性率为15.00%。本次调查研究结果与上述调查基本一致。