高分辨率熔解曲线（high resolution melting，HRM）分析技术，是用于基因分型和突变筛查的一项新兴技术，其不需要荧光标记探针和分离步骤^[1]，主要用于物种鉴定、基因分型和微生物检测等领域^{[1, 2, 3, 4, 5]}。可识别产物片段中极小碱基差异，包括单核苷酸多态性^[6]（single nucleotide polymorphisms，SNP），可检测已知或未知突变位点，实现分型。HRM分析技术主要依靠核酸分子片段大小、GC含量等物理性质实现区分。该技术操作简单，重复性高，结果准确可信^[7]；通量大，可同时检测样本384个^[8]；成本低，仅需加入饱和荧光染料^[9]；节约时间，几分钟即可完成；避免污染，操作过程完全封闭，对产物无损伤，可用于测序。鉴于以上诸多优势，HRM分析技术现已广泛应用于生命科学、农学、畜牧业等领域，如SNP位点的扫描和基因分型、物种鉴定及品种鉴定、法医学鉴定、人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）配型和甲基化研究等。

目前节肢动物分类鉴定主要为传统形态学方法，但多用于成虫，对幼虫、蛹等鉴定有所限制；尤其是形态相似的近缘种鉴定，准确度偏低；对不完整样品，存在诸多困难。随着分子生物学技术的快速发展，随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、限制性内切酶片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）等分子标记技术逐渐被应用到物种鉴定中。RAPD技术灵敏度高，简便易行，省时省力，无需克隆或同位素标记等预备工作，但影响因素较多，重复性低，结果不稳定。RFLP技术可检测突变类型，但实验操作繁琐，周期冗长，成本昂贵，有放射性危害。AFLP技术为RAPD和RFLP结合的产物，具有重复性高，分辨率强等优点，但费用高昂，且对技术和人员素质要求高。鉴于以上情况，目前已有学者将HRM分析技术引入节肢动物的鉴定中。

Kang和Sim^[10]以尖音库蚊复合组(Culex pipiens Complex)乙酰胆碱酯酶-2（ace-2）基因为研究对象，利用实时荧光定量PCR（quantitative Real-time PCR，Q-PCR）和HRM分析技术，对骚扰库蚊(Cx. pipipens molestus)、致倦库蚊(Cx. pipiens quinquefasciatus)和尖音库蚊指名亚种(Cx. pipiens pipiens)进行多重SNP分析。结果显示，3个蚊种在74.4～75.4 ℃均有各自特定的熔解温度，以尖音库蚊指名亚种的熔解曲线为参考基线，骚扰库蚊和致倦库蚊的熔解曲线峰形差异明显，重复性高，说明多重HRM分析技术可用于分类鉴定尖音库蚊复合组蚊虫。

Swisher等^[11]利用HRM分析技术，发现存在于美国西南部的第4种马铃薯木虱单体型。研究人员以细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（cytochrome c ox_idase subunitⅠ，COⅠ）基因为目标基因，对扩增产物HRM分析，已确认3种单体型的熔解曲线作为参考基线，推断出第4种单体型，称为西南部单体型。测序结果表明，西南部单体型包含2处未见于其他3种单体型的SNP位点，限制性酶切结果也证实新发现的西南部单体型不同于其他3种单体型。

邓建强等^[12]利用HRM分析技术对昆虫种属进行鉴定。通过对昆虫线粒体COⅠ和16S rDNA区扩增检测，利用HRM分析技术和DNA测序技术，结果表明HRM分析方法对COⅠ基因和16S rDNA基因检测均有检测峰，DNA测序成功获得COⅠ基因区，但未能成功测序16S rDNA基因区，可能是扩增量过少。两种方法对昆虫胸部、腿部和头部组织检测结果具有很好的一致性，但HRM分析技术操作简便，经济高效，避免污染，较DNA测序技术更具优势。

传统细菌鉴定方法主要是从形态与生理生化、蛋白质、细胞组分、核酸4个水平进行。前3种方法统称为表型鉴定法，包括宏观菌落形态学观察、涂片染色观察、生化反应鉴定等；核酸水平鉴定主要运用分子生物学技术分析细菌染色体或DNA，包括PCR技术、测序技术等^[13]。随着仪器分析和计算机技术广泛应用，仪器自动化鉴定已广泛开展，细菌鉴定逐渐由人工鉴定阶段发展为仪器自动化鉴定阶段，但均存在不足。传统鉴定方法操作繁琐，耗时长；仪器自动化鉴定虽操作简便，但无法鉴定数据库以外的菌种；核酸鉴定成本高、周期长，目前多用于科研。因此，应将HRM分析技术用于细菌鉴定。

布鲁氏菌在不同物种感染中表型不同，且存在显著的基因型差异。Gopaul等^[14]对布鲁氏菌进行全基因组测序，确定5个可用于分型的SNP位点，针对这些位点分别设计引物进行HRM分析，并通过优化引物浓度等反应条件，实现多重HRM分析，根据熔解曲线动力学变化确定物种。对135株起源于陆地和海洋的布鲁氏菌进行验证分析发现该反应体系可将5种布鲁氏菌与其他菌种区分开。

Jin等^[15]选取53株李斯特菌株和45株非李斯特菌株，以一段李斯特菌中的可变域，其他细菌中保守基因作为研究对象，运用Q-PCR和HRM技术对其进行分型鉴定。结果表明该方法可鉴别英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、西尔李斯特菌、格氏李斯特菌、单核细胞增生李斯特菌、威尔斯李斯特菌6种李斯特菌，准确率达100%。

真菌感染早期检出率的高低是临床治疗成功与否的关键，对于真菌鉴定，常用的血培养方法灵敏度低，非培养鉴定方法如免疫印迹分析成本高，均不适用于临床检测。因此，亟需一种快速可靠的鉴定真菌的方法^[16]。

Somogyvari等^[17]选取真菌rDNA内部转录间隔区2(ITS2)的部分序列作为研究对象，利用HRM技术扩增长度不等的核酸片段。结果显示，以白色念珠菌的熔解曲线作为参考基线，可以鉴别所有受试的15种菌株，并且熔解曲线峰出现顺序与荧光强度降低先后顺序一致，验证了HRM分析技术的准确性，说明该技术可用于真菌鉴定。Nemcova等^[18]将Q-PCR和HRM分析技术相结合，对25株念珠菌标准株和143株临床菌株表型鉴定和对ITS2测序分析，将所有菌株分为27种，其中23种可通过HRM分析技术准确鉴定。

Gago等^[19]通过对新生隐球菌rDNA内部转录间隔区1(ITS1)序列设计引物，扩增一段含多个SNP位点的片段，借助HRM分析技术对隐球菌进行分型。结果显示，以菌株H99的熔解曲线作为参考基线，可以将受试的23个样本分为5组，实现准确分型。

病毒是一类不具细胞结构，具有遗传、复制等生命特征的微生物，结构简单，严格寄生，体积小，以纳米为测量单位，普通光学显微镜下很难看到。目前病毒检测主要依靠电子显微镜观察、组织细胞培养、病毒抗原检测、动物实验和血清学鉴定等方法，但均存在不足。电镜价格昂贵，同时还需超速离心或抗体凝集，难以成为常规方法。由于并非所有病毒都能在培养细胞中生长，因此组织细胞培养鉴定病毒受到一定限制。病毒抗原检测虽灵敏度和特异性高，但抗体制备成本昂贵。部分病毒只能引起某种敏感实验动物致病，对于这类病毒，动物实验不可替代，但其他病毒则不适用。血清学鉴定简单、快速、敏感且特异，但对反应条件要求严格，pH、温度等因素对鉴定结果影响较大。目前已有研究人员将HRM分析技术用于病毒鉴定与分型。

根据H和N抗原不同，甲型流感病毒可被分为多个亚型^[20]，其抗原性易变异，曾多次引起大流行，因此对不同亚型快速准确鉴定尤为重要。Nemcova等^[21]选取甲型流感病毒的一段基因作为研究对象，利用HRM分析技术，对H1N1、H3N2、H5N1、H7N3、H9N2五种主要甲型流感病毒亚型实现精确分型。选取21株来自临床的病毒样本验证，HRM分型结果与流感血凝素特异性引物分型的结果完全一致，说明HRM分型方法准确性高。除此之外，运用该方法还可以对新病毒变异进行筛查。Kalthoff等^[22]借助反向遗传技术^[23]和HRM分析技术，扩增出8段含有2～4个SNP位点的片段，对体外培养的重组甲型流感病毒鉴定分型。对18株病毒株分析鉴定结果表明，HRM分析技术能够快速准确地鉴定重组甲型流感病毒，并有望在筛查流感病毒是否重组或突变及重组病毒鉴定领域发挥重要作用。

野生型甲型H1N1流感病毒发生823C＞T突变后，变异为突变株H275Y，该突变被证实与奥司他韦耐药有关^{[24, 25, 26]}。Lee等^[27]将非标记单链探针技术和HRM分析技术结合，将标准突变株和野生株cDNA模板按不同比例混合进行HRM分析，结果显示，未混样野生株和突变株分别在66.5 ℃和69.0 ℃出现熔解峰，混样组熔解峰出现的位置不变，但峰值高低会随两种组分的比例不同而呈现此消彼长现象。利用该方法，研究人员成功检测出3例H257Y突变株样本，7例混合样本，104例野生株样本和1例非特异性突变样本，经测序发现该病毒株发生1处816T＞C同义突变。对突变株和野生株进行量化分析，能够快速地对正确用药给予指导性建议，并有望应用于鉴定其他潜在流感病毒突变株。

原虫为单细胞真核生物，疟原虫、利什曼原虫、溶组织内阿米巴等原虫感染会对人体造成严重危害。原虫感染因其症状、传播方式、寄生部位等不同，部分感染（如疟原虫感染）具有周期性，对原虫感染快速、准确诊断至关重要。

利什曼原虫泛指利什曼虫属的锥体虫科原虫，通过白蛉叮咬传播给人类^[28]。Hernéndez等^[29]利用HRM分析技术以HSP70和ITS1为目标基因，对6种利什曼原虫进行基因分型。后续的验证实验分别选取35例来自感染人类、病媒昆虫和哺乳动物的样本，结果与RFLP、多位点酶电泳(MLEE)和单克隆抗体(MA)检测结果一致，因此可用于利什曼原虫的分型检测和分子流行病学研究。

丝虫病是一种蚊媒传播疾病，主要由班氏丝虫、马来丝虫和帝汶丝虫引起^[30]，我国常见为前两种。Thanchomnang等^[31]以班氏丝虫、马来丝虫、帝汶丝虫和犬恶丝虫为研究对象，扩增5S核糖体RNA，HRM技术分析。4种丝虫分别在（81.5±0.2）、（79.0±0.3）、（76.8±0.1）和（79.9±0.1）℃出现熔解峰，表明该方法可有效鉴别上述4种丝虫，特异性和敏感性均为100%，可快速筛查丝虫病感染。

HRM分析技术因其简单、准确、通量高、成本低、速度快等特点，在基因分型、突变筛查中广泛应用，其可以减少测序环节。即便HMR分析失败，由于HRM对DNA无损伤，样本还可以直接用于测序。在节肢动物、细菌、真菌、病毒和原虫的鉴定分类及基因分型中，HRM分析技术已显示较强的鉴定能力和优势，并将在其他领域发挥作用。