鼠疫是烈性传染病，未及时诊断或漏诊，均可导致患者死亡或疫情扩散。因此，建立鼠疫快速、敏感、特异、简便的检测方法可为鼠疫应急和控制提供重要依据。酶免疫染色法检测鼠疫菌可以突出地体现鼠疫的特异性抗原特征。应用酶免疫染色法在光学显微镜下观察鼠疫菌，1 h左右即可获得结果，实验要求简单，方便现场应用。本研究通过辣根过氧化酶标记鼠疫F1单克隆抗体(HRP-F1McAb)免疫染色法检测鼠疫菌，并与反向间接血凝试验(RIHA)和胶体金纸上色谱法(RGICA)对比，评价酶免疫染色法快速检测鼠疫菌效果。

HRP-F1McAb，由兰州生物制品研究所提供（批号：20121201）；鼠疫RIHA试剂盒，中国疾病预防控制中心鼠疫布鲁氏菌病预防控制基地2014年产品；鼠疫F1抗原GICA试纸条，为北京庄笛浩禾生物公司产品（批号：20130225）。固定液，柠檬酸0.5 g，75%乙醇100 ml，30% H2O2 5 ml。洗涤液，0.01 mol/L pH值7.2的PBS加2%新生小牛血清，含0.05%吐温80，含0.1% HgCl2。底物染色液配制 Kaplow氏染色液^[1]：100 ml 30%乙醇，0.3 g盐酸联苯胺，1 ml 3.8%ZnSO4·7H2O，1.0 g NaC2H3O2·3H2O，1.5 ml 1 mol/L NaOH，0.2 g藏红O，按顺序每加一种试剂，充分振荡使其混匀，pH值调至6.0，过滤后置棕色瓶内，室温保存。每次取10 ml加0.05 ml 30% H2O2。OLYMPUS?CX21光学显微镜，本所实验室提供。

河北省鼠疫疫源地分离的鼠疫强毒菌接种小白鼠和豚鼠266只^[2]；对照小白鼠5只，豚鼠3只，长爪沙鼠(Meriones unguiculatus)、达乌尔黄鼠(Spermophylus daurius)、黑线仓鼠(Cricetulus barabensis)、黑线毛足鼠(Phodopus sungorus)、小毛足鼠(P. roborovskii)、五趾跳鼠(Allactaga sibiricia)、沙狐(Vules corsac)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、小家鼠(Mus musculus)共199只均来自河北省鼠疫自然疫源地。

（1）制片：取肝、脾脏器在玻片上印片，每份样本2张涂片，自然干燥；或取肝、脾脏器0.3 g，置1%升汞盐水试管内剪碎，静置10 min或低速离心3 min（500×g），取上清液涂片。（2）在固定液中固定涂片10 min，冲洗1 min。将洗涤液封闭涂片5 min弃去。其中做抑制试验的1张涂片加入鼠疫F1抗体应用液覆盖，37 ℃ 5 min，冲洗1 min。（3）与HRP-F1McAb反应：加入HRP-F1McAb应用液，置湿盒内37 ℃保持30 min，冲洗1 min。（4）显色：Kaplow氏染液反应5 min，冲洗。光学显微镜1 000×镜检，含有鼠疫F1抗原的鼠疫菌体被蓝色晶体覆盖，晶体和菌体平行，呈丝状或棒状；非鼠疫菌体或其他组织细胞呈淡红色。

参照《鼠疫诊断标准》(WS 279－2008)附录E和附录F。

采用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析，不同检测方法标本阳性率比较与一致性检验采用配对设计四格表χ²检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

266只（198只小白鼠、68只豚鼠）强毒菌接种鼠脏器标本HRP-F1McAb酶免疫染色、RIHA和RGICA检测结果见表 1。207只对照实验啮齿动物脏器标本，包括小白鼠5只，豚鼠3只，长爪沙鼠116只，达乌尔黄鼠37只，黑线仓鼠33只，黑线毛足鼠2只，小毛足鼠3只，五趾跳鼠及沙狐各1只，褐家鼠4只，小家鼠2只，HRP-F1McAb酶免疫染色和RIHA检测结果均为阴性。

表 1 266只强毒菌接种鼠脏器标本HRP-F1McAb 酶免疫染色、RIHA和RGICA检测F1抗原结果

表选项

HRP-F1McAb酶免疫染色和RIHA检测473只啮齿动物脏器鼠疫F1抗原一致率为98.52%（466/473），Kappa值为0.970，阳性检出率差异有统计学意义（χ²＝5.140，P＝0.016）；HRP-F1McAb酶免疫染色和RGICA检测鼠疫266只强毒菌接种鼠脏器标本F1抗原结果，一致率为98.50%（262/266），Kappa值为0.901，阳性检出率差异无统计学意义（χ²＝0.250，P＝0.625），见表 2。

表 2 实验啮齿动物脏器标本HRP-F1McAb酶免疫染色、 RIHA和RGICA检测F1抗原结果比较

表选项

以RIHA检测鼠疫菌F1抗原为参照，检测473只啮齿动物脏器标本，HRP-F1McAb酶免疫染色法灵敏度为100%（238/238），特异度为97.02%（228/235），约登指数为0.970，阳性预测值为97.14%（238/245），阴性预测值为100%（228/228）。

实验室检测结果是制定实施鼠疫防控措施的重要依据。细菌学检测、基因检测和F1抗原检测(RIHA、RGICA和ELISA)已列为我国卫生行业鼠疫诊断标准。酶免疫化学法的优点是敏感性较高、方法简单，适合于一般病原微生物检测^[3]。HRP-F1McAb酶免疫染色法是针对鼠疫F1抗原的检测。HRP-F1McAb与组织中F1抗原发生特异性反应，通过辣根过氧化酶的催化作用，底物盐酸联苯胺生成不溶性蓝色产物，显示被检标本中F1抗原的位置和性质。HRP-F1McAb酶免疫染色法与其他3种检测鼠疫F1抗原的检测方法相同点为无论细菌是否存活、标本新鲜与否，均可检测到鼠疫F1抗原^{[4, 5, 6, 7]}。实验所使用的特异性抗体纯度是建立特异性酶免疫检测方法的关键因素^[8]，应用F1McAb可排除因F1Ab纯度差导致的交叉反应，并提高检测结果特异性。

HRP-F1McAb酶免疫染色法和RIHA、RGICA检测鼠疫F1抗原实验结果比较显示，HRP-F1McAb酶免疫染色法的非特异性反应很少，作为鼠疫快速诊断技术，其敏感性和特异性可靠。在本实验中，72号（达乌尔黄鼠）、70号和122号（长爪沙鼠）标本在初筛中显示出非特异性染色阳性，但是通过鼠疫F1抗原抑制实验消除了这些假阳性结果，保证了检测结果的准确性。

HRP-F1McAb酶免疫染色法检测鼠疫菌F1抗原敏感、特异、快速、简单，在我国鼠疫防治工作中具有很好的应用前景。