河北省鼠疫自然疫源地位于康保县境内，疫源地面积达1 000 km²，北部与内蒙古的白旗、太仆寺旗以及化德县相邻，为内蒙古长爪沙鼠（Meriones unguiculatus）鼠疫疫源地和吉林省达乌尔黄鼠（Spermophilus dauricus）鼠疫疫源地的重叠区^[1]。由于特殊的地理位置，使该省的鼠疫防控工作显得更为重要。为加快对突发疫情追踪溯源，利用快速而又简便的基因分型技术对鼠疫菌准确分析，进行多位点可变数目串联重复序列（VNTR）。经过多年的发展，该技术已经成熟地应用于多个领域，在鼠疫菌分型中已有研究。实验中VNTR位点的选择，对于菌株分型的成功与否起关键作用。本研究用14＋12分级分型方法系统地对我国不同鼠疫疫源地的鼠疫菌分析、建立关联，为后续研究提供技术支持。

实验所用116株鼠疫菌均分离于河北省鼠疫疫源地，见表 1。

表 1 鼠疫菌株信息 Table 1 The information of Yersinia pestis stains

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PCR扩增仪（杭州博日科技有限公司），高速台式离心机（Eppendorf 5424）、水平电泳仪（北京市六一仪器厂），凝胶成像仪（上海基因有限公司）。DNA提取试剂盒购自Qiagen公司，PCR扩增试剂购自北京全式金生物技术有限公司，DL500 Marker购自宝生物（大连）工程有限公司，100 bp Marker购自北京赛百盛基因技术有限公司，琼脂糖购自西班牙Biowest公司。

采用14＋12对VNTR设计引物，引物信息见表 2。

表 2 引物序列信息 Table 2 The primer information

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冻干菌株经营养琼脂培养基28 ℃、24～48 h复苏，分离培养，做噬菌体实验，Qiagen试剂盒提取DNA。

①反应体系：总体积25.0 μl，其中SuperMix混合液12.5 μl，上、下游引物各1.0 μl，模板1.0 μl，补水至25.0 μl；②PCR反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，退火温度根据预期片段长度进行相应的调整，如引物为M58、yp3060、yp4425、M21、M15、M61、M25、M23时，退火温度为60 ℃，引物为yp3057、N2486、yp3236、yp0718、M34、M33、M22、M43M28、M29时，退火温度为55 ℃，而引物为N3779、N2896、N0865、N2976、N1606、N2577、N3773、N2117体系的退火温度为52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 5 min。

取扩增产物6 μl，Marker 6 μl，1.5%琼脂糖凝胶，120 V，40 min电泳后，经凝胶成像仪分析，每次实验均以EV为对照，对于扩增条带不清晰，或未出条带的菌株进行重复实验。

测序并统计菌株，对各对引物的重复数进行聚类分析。

26个VNTR在河北省鼠疫菌基因组中的重复结果见表 3，大多数VNTR均表现出不同于CO92和EV的特有重复次数，只有3对引物未能将EV和鼠疫菌株的重复次数分开，证明这些引物的分辨能力较高，河北省鼠疫菌株的多位点可变数目串联重复序列分析（MLVA）自成一型。

表 3 26个VNTR分别在菌株基因组中的重复次数 Table 3 The number of repetition of 26 VNTR in strains of Yersinia pestis

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14＋12对VNTR引物针对EV菌DNA和野生鼠疫菌DNA的电泳图不同，见图 1、2，说明利用MLVA方法可以确认为自然感染鼠疫菌还是实验室污染。

注：每个引物所对应的电泳条带从左起依次为EV和9420菌株。 图 1 22对引物分别对EV和9420菌株的电泳结果 Figure 1 The electrophoretogram of the EV and 9420 strain amplified with 22 pairs of primers

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图 2 4对引物分别对EV和9420菌株的扩增电泳结果 Figure 2 The electrophoretogram of the EV and 9420 strain amplified with other 4 pairs of primers

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所有分离菌株基因分型同一引物在河北省鼠疫菌株中重复次数相同，说明河北省鼠疫菌株的MLVA基因型只有1种，见图 3。

图 3 相同引物对不同鼠疫菌的扩增电泳结果 Figure 3 The electrophoretogram of different Yersinia pestis strains using same primes

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在鼠疫菌基因组中，首尾相连的串联重复序列很多^[2]，VNTR决定MLVA基因分型的质量，数量太少无法将我国的鼠疫菌合理分型^[3]，数量太多增加实验成本^[4]，所以合理选择VNTR很关键^[5]。已有文献报道，本实验所选用的14＋12 VNTR指标可以将我国的鼠疫菌进行合理分型^[6]。本研究结果显示，在这一分型体系下河北省鼠疫自然疫源地的鼠疫菌均为同一基因型，未表现出多态性。

河北省鼠疫疫源地虽然属于内蒙古长爪沙鼠型疫源地，其菌株生态型也同属于鄂尔多斯高原型^[7]，但是由于地理环境的不同，菌株的保存机制和遗传特征也不同，在DFR（差异区段）基因分型^[8]和生化分型^[9]中均已证实，而通过之前的VNTR实验^[10]、DFR分型实验以及本次使用14＋12 VNTR分型的实验结果均证明河北省分离的菌株其基因型一致，并未出现遗传多样性变化。河北省鼠疫疫源地与内蒙古长爪沙鼠疫源地自然相连，其间无明显的高山或河流等自然地理屏障，且流行并不频繁，菌株变异的机会少，而且流行区域比较集中，没有新的生态环境致使菌株产生新的基因型。因此，通过此次实验探明河北省鼠疫菌的MLVA基因型别，给将来流行病学的追踪溯源提供了技术资料，为我国今后开展鼠疫菌突变监测奠定了基础。通过对该鼠疫疫源地的连续监测，可及时发现和控制因鼠疫菌基因组结构变化而引起的鼠疫突发事件。