淡色库蚊（Culex pipiens pallens）是常见的家栖蚊种，主要分布在北纬33°以北，其刺叮吸血、传播疾病、影响人类工作和生活。幼虫主要孳生于污水坑、污水沟、水塘、集水井等不易清除积水的场所，主要以化学防治为主。化学杀虫剂的长期、大量、广泛使用或滥用，导致淡色库蚊抗性增强^{[1, 2]}，甚至出现交互抗性现象，大大增加了淡色库蚊的防治难度。吡丙醚，一种非杀性杀虫剂，通过抑制昆虫几丁质的合成，导致昆虫无法正常变态而死亡^{[3, 4]}。最早登记于日本，主要用来防治蚊、蝇幼虫及蜚蠊，目前在我国已经陆续应用于卫生害虫尤其是淡色库蚊的防治^{[5, 6]}。随着吡丙醚在蚊虫防治上的广泛使用，导致农业害虫烟粉虱对吡丙醚产生抗性^{[7, 8]}，少数淡色库蚊和家蝇（Musca domestica）对吡丙醚也产生抗药性^{[4, 9]}，大大降低了吡丙醚的杀灭效果。

羧酸酯酶是昆虫体内一类重要的解毒酶系，在昆虫对杀虫剂体内代谢中起着重要作用。目前主要研究羧酸酯酶在有机磷、除虫菊酯类杀虫剂抗性中的作用，但羧酸酯酶是否参与昆虫生长调节剂类杀虫剂的抗性未得到广泛深入研究。本研究通过室内筛选抗吡丙醚淡色库蚊品系，比较分析淡色库蚊两种蚊虫品系羧酸酯酶的生化参数，初步探讨其生物化学抗性机制，对延缓淡色库蚊吡丙醚抗性以及提高其防治效果具有重要意义。

淡色库蚊敏感品系，长期饲养于实验室内，期间未接触任何杀虫剂；淡色库蚊抗吡丙醚品系，室内吡丙醚选育12代。

乙酸-1-萘酯（α-naphthyl acetate，α-NA）、乙酸-2-萘酯（β-naphthyl acetate，β-NA）、1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）、1,2-二氯-4-硝基苯（DCNB）以及固蓝B盐均购自Sigma 公司；丙酮为国产分析纯。冷冻离心机（BioRad 公司），紫外-可见分光光度仪（上海光学仪器公司），电子天平-Sartorius 2004MP（Opton公司）；恒温水浴锅（上海科技器材有限公司）。

取3龄末4龄初淡色库蚊幼虫，根据上一代的生物测定浓度，配制杀死种群70%左右的药剂剂量。采用WHO推荐的幼虫浸液法，处理24 h后将存活的幼虫转移至干净的搪瓷盆中正常饲养、繁殖。逐代筛选幼虫并测定其敏感性。

采用幼虫浸液法。用丙酮将吡丙醚母液按一定比例稀释至5～7个浓度；将1 ml测试药液加入含有199 ml脱氯自来水的搪瓷碗中。每处理30条幼虫，丙酮作为对照。实验重复3次。24 h后记录幼虫死亡数及蛹羽化数。

挑选均一的4龄初淡色库蚊幼虫，称取一定重量后放入研钵器中，4 ℃冰浴加入磷酸缓冲液（0.04 mol/L，pH值7.0）匀浆，10 000×g离心20 min，取上清液作为粗酶液。

参照van Aspern（1962）的方法并略加修改。将含有3×10^-4 mol/L毒扁豆碱的底物和0.5 ml粗酶液分别加入不同试管中，30 ℃水浴反应15 min后，加入固蓝B盐缓冲液显色，静止5～10 min后在600 nm（α-NA）或550 nm（β-NA）下测定吸光度。对照管在加入固蓝B缓冲液后补加酶液。实验重复3次。

将两种底物分别稀释成8～10个浓度梯度，测定两种蚊虫品系羧酸酯酶在不同底物浓度下的吸光度，计算比活力。实验重复3次。

参考Bradford考马斯亮蓝G250法并略加修改。取含10～120 μg酶液分别溶解于试管中，用磷酸缓冲液稀释至0.5 ml，然后加入2.5 ml考马斯亮蓝，充分混和，2 min后于595 nm测定吸光度，空白对照加入等量的磷酸缓冲液。

将不同浓度梯度的两种抑制剂（敌敌畏、残杀威）分别与淡色库蚊CarE粗酶液在30 ℃水浴中保温5 min，然后分别加入一定量底物，正常反应15 min后，加入固蓝B缓冲液显色，600 nm下测定吸光度。每种药剂7个浓度，每个浓度重复3次。

用Enzifit software 分析底物的米氏常数（K_m）和最大反应速度（V_max），采用Graphpad InStat 3.0 软件进行统计学分析。

经过12代的室内选育，淡色库蚊幼虫对吡丙醚的LC₅₀从0.056 5 mg/L提高至0.321 6 mg/L，抗性倍数达到5.69倍，表明连续12代的抗性筛选使淡色库蚊幼虫对吡丙醚产生了一定抗性，见表 1。

表 1 淡色库蚊幼虫对吡丙醚的抗性 Table 1 History of selections with pyriproxyfen of the resistant Cx. pipiens pallens

表选项

抗吡丙醚品系和敏感品系蚊虫离体羧酸酯酶对α-NA和β-NA两种底物的水解趋势相似（图 1），比活力随着底物浓度的增加而逐渐升高。结果显示，淡色库蚊离体羧酸酯酶对β-NA的水解活性高于对α-NA的活性。一定浓度范围内，相同底物浓度下，抗性品系蚊虫羧酸酯酶比活力高于敏感品系，表明羧酸酯酶可能在吡丙醚抗性中起着一定解毒作用（图 2）。

图 1 淡色库蚊敏感品系及抗性品系CarE对底物的水解趋势 Figure 1 The hydrolyzing tendency of CarE from S and R strain of Cx. pipiens pallens to two substrates

图选项

图 2 两种品系淡色库蚊对α-NA和β-NA的水解趋势比较 Figure 2 The hydrolyzing tendency of CarE from S strain and R strain of Cx. pipiens pallens to α-NA and β-NA

图选项

抗吡丙醚蚊虫品系羧酸酯酶对底物β-NA的K_m和V_max与敏感品系比较差异有统计学意义（t_b＝2.740，t_c＝3.160，P＜0.05），见表 2；但对α-NA而言，两种蚊虫品系的V_max差异有统计学意义（t_a＝2.720，P＜0.05），而Km间的差异则无统计学意义（t＝1.640，P＜0.05）。羧酸酯酶调节的解毒代谢抗性机制有较强作用。

表 2 淡色库蚊不同品系羧酸酯酶酶动力学常数测定 Table 2 Kinetic parameters to two substrates in the R strain and S strain of Cx. pipiens pallens

表选项

在浓度相同情况下，抑制剂对酶抑制率的差异反映了酶性质差异。抑制率越大，表明酶对抑制剂越敏感；反之酶对抑制剂越不敏感。敌敌畏和残杀威对淡色库蚊敏感和抗性品系羧酸酯酶的抑制能力不同（图 3）。浓度相同情况下，敌敌畏和残杀威对抗吡丙醚蚊虫离体羧酸酯酶的抑制率高于敏感品系，说明抗吡丙醚品系羧酸酯酶比敏感品系羧酸酯酶对敌敌畏和残杀威更敏感。

图 3 残杀威和敌敌畏对淡色库蚊抗性品系和敏感品系抑制率比较 Figure 3 Comparison of the inhibition of esterase by propoxur and DDVP esterase by from from R and S strain of Cx. pipiens pallens

图选项

以吡丙醚为代表的昆虫生长调节剂在我国已广泛应用于卫生虫媒的防治，但人们普遍认为昆虫生长调节剂不易产生抗性，多年来对昆虫生长调节剂的抗性研究较少。国外研究报道，野外发现对吡丙醚产生抗性的淡色库蚊和家蝇，抗性倍数达20倍以上^{[4, 9]}。本研究表明，室内连续筛选12代后淡色库蚊对吡丙醚的抗性倍数也达到5.69倍；由此推断，长期大量使用吡丙醚防治淡色库蚊，会导致抗性产生。

唐振华和吴士雄^[10]指出抗性和敏感个体的酯酶活性差异表现出量的差异或质的差异，抗性昆虫的酯酶分子可能会因酶分子发生变构而具有更强的解毒能力，即与敏感昆虫个体相比，抗性昆虫个体可能会合成更多的酶而增加解毒能力。本研究表明，淡色库蚊抗性品系比活力为敏感品系的1.74倍，且两者差异显著，说明随着抗性增加，淡色库蚊体内的羧酸酯酶活力也逐渐增加，提示淡色库蚊对吡丙醚抗性增加可能与羧酸酯酶活力增加有关。胆碱酯酶抑制剂对淡色库蚊羧酸酯酶抑制实验表明，敌敌畏和残杀威对淡色库蚊敏感和抗性品系羧酸酯酶的抑制存在差异。相同浓度下，敌敌畏和残杀威对淡色库蚊抗性品系羧酸酯酶的抑制率高于敏感品系，说明淡色库蚊抗吡丙醚品系的羧酸酯酶比敏感品系羧酸酯酶对敌敌畏和残杀威敏感，表明淡色库蚊羧酸酯酶在有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂抗药性中的作用机制不同。

羧酸酯酶是昆虫体内重要的解毒酶系，主要以水解蛋白和结合蛋白两种方式对杀虫剂解毒，了解淡色库蚊对吡丙醚的生物化学抗性机制，对于抗药性治理具有非常重要的指导意义。