在历史上鼠疫曾给人类造成巨大的灾难，随着近年来鼠疫病例的增加，WHO将鼠疫列为重新抬头的传染病。鼠疫也是一种自然疫源性疾病，目前我国仍然存在着12种不同类型的鼠疫疫源地，分布于我国西北、西南的大部分省（自治区）。在一些相对活跃的鼠疫疫源地，每年都发生动物鼠疫的流行，有时会波及到人类，发生人间鼠疫流行。因此，及时发现和追溯鼠疫感染来源始终是我国鼠疫防治的重要内容。近年来，随着不同分子生物学方法的应用，使对鼠疫菌的快速鉴定、追溯和基因分型上升到一个新的阶段。通过对一些方法的比较，多位点可变数目串联重复序列分析（multiple loci vntr analysis，MLVA）在分辨率、重复性和可操作性方面显示更具优势，分型能力最强^[1]，可以区分不同来源的鼠疫菌并建立亲缘关系。对可变数目串联重复序列（variable-number tandem repeat，VNTR）位点的选择与组合，可直接影响MLVA分型及结果分析，现就VNTR在国内外鼠疫菌基因分型的应用现状及前景做一介绍。

VNTR广泛的存在于真核生物和原核生物基因组中，以一段相同或相似的核苷酸序列为重复单位（也称为核心序列），依据核心序列长度不同可分为3种：核心长度为几百个bp之间的为卫星DNA，核心长度为10～100 bp之间的为小卫星DNA，核心长度＜10 bp的为微卫星DNA，通常把中小卫星DNA称作VNTR^[2]。而在同一物种的不同个体之间表现出不同的重复数形成了种内的遗传多样性。将多个位点的VNTR组合进行个体鉴别的方法，称为MLVA。 鼠疫菌基因组序列分析显示，在鼠疫菌基因组编码区中存在着较大数量的串联重复序列，它们分别贯穿于整个染色体基因组和两个毒力岛pCD1和pMT1中，而同一位点的串联重复序列在不同的鼠疫菌株间存在着多样性，串联重复序列在鼠疫菌中存在的这个特点十分有利于鼠疫菌的分型。鼠疫菌的MLVA基因分型正是利用了这些不同的VNTR组合作为引物，进行PCR扩增，然后再通过电泳测序等方式，来确定菌株的重复数，并用Bionumerics 软件进行聚类分析，确定基因型，建立鼠疫菌鉴定溯源数据库。

我国鼠疫自然疫源地类型多样，不同疫源地宿主、媒介和鼠疫菌之间均存在很大的差异，即使同一鼠疫自然疫源地菌株的生态型也不一定相同。20世纪50年代，Devignat^[3]根据鼠疫菌是否酵解甘油和还原硝酸盐，将鼠疫菌分为3种生物型：古老变种、中世纪变种和东方变种。20 世纪80 年代，纪树立等^[4]根据鼠疫菌的生化特点、宿主和分布地区将鼠疫菌分为五大群17 个生态型，这项工作对我国的鼠疫防治起到了重要的指导作用。进入20世纪90年代，随着鼠疫分子生物学技术的快速发展，鼠疫菌的基因分型方法日渐成熟，尤其是在对感染来源的调查方面占据了明显优势。例如单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）、差异区段（different region，DFR）、插入序列（insertion sequence，IS）、间区规律聚积短回文重复（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPA）、MLVA等。然而尽管这些方法均具有自身的优点，但也还有一些无法避免的缺陷，尚不能完全区分所有类型鼠疫菌之间的亲缘关系。

2001年，Klevytska等^[5]利用Genequest和SSR search program对鼠疫菌CO92全基因组进行了分析，发现串联重复序列在鼠疫菌的染色体和质粒中广泛存在并呈随机分布状态，有53%的串联重复序列位于开放读码框（ORF）内，其中多数的核心序列为3 bp或3 bp的整数倍，这些重复序列虽然不会改变读码框的结构，但可以改变编码蛋白的氨基酸序列，而导致表型的改变，也有相当一部分核心序列为7 bp或8 bp。以上研究为MLVA分型方法奠定了基础。因此，根据不同的重复数进行鼠疫菌基因分型，建立最小进化树，分析不同疫源地或同一疫源地鼠疫菌之间的亲缘关系，进行鼠疫感染来源快速调查，及时控制疫情仍然是当前我国鼠疫防控的重要内容之一。

2001年，Klevytska等在CO92全基因序列中筛选出46个VNTR位点，其位点命名形式为M加数字，并在此基础上将12株分属于古典变种、中世纪变种和东方变种的鼠疫菌进行了分型。2004年，Pourcel等^[6]通过TRF（tandem repeat finder）软件，在CO92基因组中寻找重复基因序列＞9 bp，重复次数≥7的VNTR位点，发现了符合条件的64个位点。另外，在重复数为6的49个VNTR位点中，选择最为保守的12个位点，并设计了这76个位点的引物，对5株耶尔森菌（3株鼠疫菌和2株假结核菌）进行PCR扩增。结果有6个位点扩增产物为阴性，21个位点的重复数在所有耶尔森菌中一致，未发现多态性。剩余49个位点中，有25个位点在鼠疫菌中表现出了多态性。Pourcel等^[6]在上述研究结果的基础上建立了MLVA数据库。2013年，为了筛选出适合于我国鼠疫菌分型的VNTR位点，杨瑞馥等选用了64个已发表的VNTR位点，并延续其文献中的命名方式即来源于Klevytska文章中的VNTR位点命名为“M＋数字”，来自于Pourcel文章中的VNTR位点命名为“yp＋数字＋ms＋数字”，通过对CO92、Nepal516、Antiqua、KIM和 91001五株鼠疫菌进行VNTR位点的寻找，发现其中有24个位点在这5株菌中表现出差异，而以前文献未曾提及，命名为“N＋数字”，并最终确定了“14＋12”的分级分型方案^[7]。

早在1960年后期，人们就在真核生物基因组中获得了大量的串联重复DNA序列，并在近20年中得到越来越广泛的应用。随着研究的深入，人们在原核生物基因组中也发现了一些VNTR基因座和串联重复序列。1998年，Frothingham和Meeker-O’Connell^[8]系统地报道了结核分枝杆菌复合物中的重复序列，认为重复序列在细菌的流行病学调查、菌株鉴别、认识交叉污染文库等方面均有潜在的巨大的应用价值，特别是在菌株分型方面具有重要意义。目前在淋球菌^[9]、幽门螺杆菌^[10]、流感嗜血杆菌^[11]以及炭疽杆菌^[12]分型中得到广泛应用，2001年，Klevytska等^[5]从鼠疫菌CO92全基因组中挑选出42个有效串联重复基因座，对12株鼠疫菌进行分析，并将其成功的分组。近年来，通过所获得的鼠疫菌基因组，发展了大规模测定重复序列的方法，可以方便地利用串联重复序列进行基因分型，由于MLVA分型技术是建立在PCR的基础上，操作简便，具有较好的应用前景。

付秀萍等^[13]利用M28对16个生态型的165株鼠疫菌进行MLVA分型，证明在不同来源的菌株中，确实可以因为重复单位的增加或减少引起扩增片段长度的多态性，所以利用串联重复序列对鼠疫菌进行基因分型是一种切实可行的方法。张晓嫒^[14]根据文献筛选了14个VNTR位点对我国各鼠疫疫源地的213株鼠疫菌进行MLVA分型，发现大部分鼠疫菌基因型别和我国鼠疫菌的生态型相符，进一步补充丰富了生态型的含义。近年来的研究显示，有5个VNTR位点对云南疫源地鼠疫菌具有多态性分型意义^[15]，通过15个VNTR位点的组合可以对河北疫源地鼠疫菌进行MLVA分型，这些菌株只有一个基因型^[16]。国外有关鼠疫菌MLVA基因分型所使用的鼠疫菌株较少^{[6, 17, 18, 19]}，大部分来自于第三次世界鼠疫大流行时期，有非洲、伊朗、土耳其及少量亚洲菌株，多数为鼠李糖阴性，因此这些VNTR位点的代表性有所不足。Li等^[20]利用25个VNTR位点对我国383株鼠疫菌、38株美国和蒙古国的菌株进行分型，并将一些同属一个DFR基因型，来自于不同疫源地的菌株，划分为不同的MLVA基因型，使MLVA分型更具合理性。2013年，杨瑞馥等筛选利用14＋12VNTR分级分型方法，初步建立了我国MLVA基因分型数据库^[21]。

对鼠疫菌进行基因分型的目的主要是追溯感染来源，因此判断一种分型方法是否具有优势，主要从分辨率、重现性和操作所需时间来衡量。通过公式计算MLVA拥有最高的分辨率^[22]，其次为CRISPR、IS、DFR、SNP和生物型。虽然DFR 方法仅需要通过判断PCR 扩增结果获取数据，影响因素少，重现性比较好，但是DFR 方法在各个位点的权重是不同的，需要再进行标志位点的筛选或与其他方法进行综合判定，以避免出现误判^[23]。 MLVA利用PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，DNA用量少，重复性及特异性好，易于数字化分析，不同实验室的结果可以进行比对，其快速分型优势明显。

VNTR在细菌基因组中分布极为丰富，其蕴含的多态信息量较大，已逐渐成为个体识别的独特遗传分子标记，也可直接用于罪证鉴定、法医学检测和亲子鉴定。使用多位点VNTR分析技术时，可以获得更加强大的辨识能力并能对遗传关系进行更精确的评估。目前该方法已应用于流感嗜血杆菌、结核分枝杆菌、炭疽芽胞杆菌、鼠疫菌、嗜肺军团菌、副溶血弧菌等多种细菌的基因分型研究。2001年炭疽芽胞杆菌恐怖事件中，美国利用MLVA和全基因组序列测定技术成功调查了恐怖袭击所用菌株的来源。目前，已有数十株或更多的鼠疫菌基因组序列被测定，通过使用生物信息软件，可以获得鼠疫基因组上的所有VNTR位点，使得利用VNTR进行鼠疫菌基因分型得到更精确的结果，而且这些结果可以方便地在实验室之间进行比对，适用于对鼠疫感染来源进行快速调查。同时，通过对大量数据的分析，深入探讨鼠疫菌进化以及与自然疫源地的关系，对于鼠疫突发疫情的追踪溯源有着重要的指导意义。