植物不育剂是由具有抗生育作用天然植物中的提取物配制而成，用不育剂配制的混合饵料，对雌雄鼠生殖机能均有一定的破坏性，既起到了阻断生殖的作用，又不污染环境和破坏生态平衡^[1]。所以近年来选用植物不育剂制作环保型鼠药越来越受到人们的重视。蓖麻籽为大戟科植物蓖麻的种子，其提取物中含有蓖麻毒蛋白，蓖麻毒蛋白是一种核糖体失活蛋白，几乎对所有真核细胞具有很强的毒害作用，被认为是一种新型的具有极大潜力的生物农药^{[2, 3]}。虽然，蓖麻毒蛋白对真核具有很强的毒害作用，但以蓖麻毒蛋白制备成生物鼠药研究抗生育机制的报道较少。本实验使用由蓖麻籽的粗提物蓖麻毒蛋白作为植物不育剂，通过与鼠饵料混合作为混合饵料饲养小白鼠，研究食用混合饵料后，小白鼠睾丸和卵巢组织结构的变化及观察产仔数量的变化，为制备环保型鼠药奠定基础。

将80 g蓖麻籽磨碎浸泡在240 ml PBS（pH 7.2）缓冲液中，在4 ℃下处理20 h，用聚乙二醇吸水，离心半径为8 cm，5 000 r/min离心15 min，小心去掉上层油脂，取中间清亮液体备用^[4]（经过改造的方法）。80 g蓖麻籽可提取出90 ml提取液。提取液中含有蓖麻毒蛋白。

实验采用双缩脲反应鉴定提取液中是否有蓖麻毒蛋白。取小试管加入少许蓖麻毒蛋白提取液，先加入1 ml双缩脲试剂A液，振荡后再加入3～4滴双缩脲试剂B液，产生紫色反应，说明提取液中含有蓖麻毒蛋白。

将从西安交通大学医学院购买的小鼠饵料粉碎。蓖麻籽有效成分提取液按1∶5稀释后，以1 g/ml的比例和粉碎的小鼠饵料混合，即与450 g小鼠饵料配制成472 g混合饵料。做成饼状晾干备用。

昆明小白鼠购自西安交通大学医学院。将60只（体重20～26 g）小白鼠分为4组：第1组：15只雄鼠，以正常小白鼠饵料进行喂养；第2组：15只雄鼠，以混合饵料进行喂养；第3组：15只雌鼠，以正常小白鼠饵料进行喂养；第4组：15只雄鼠，以混合饵料进行喂养。每天每只鼠饲喂正常饵料或混合饵料10 g，自由饮水。一周换一次垫料，换垫料时称量所剩正常饵料或混合饵料的质量，喂养共30 d，称剩余饵料4次，计算不同浓度的混合饵料对小白鼠每日进食的影响，比较日进食量，日进食量（g）计算公式：（10×30－4次剩余饵料或混合饵料）/30。

30 d后，从4组小白鼠中各取出5只（共20只），称重，20%乌来糖腹腔麻醉，经左心室输入0.1 mol/L生理盐水磷酸缓冲液100～150 ml（pH 7.4），剪破右心房以使血液流出，再输入4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液300 ml（pH 7.4），立即取双侧睾丸和卵巢，测脏器系数。脏器系数＝双侧睾丸或卵巢（g）/体重（g）。

将测完脏器系数的小白鼠一侧睾丸和卵巢置于Bouin’s液中固定，做石蜡切片。切片厚度8 μm，HE染色，在显微镜下观察并测量雄性各组同一横截面生精小管管径、生殖上皮厚度。观察并测量黄体的大小。

30 d后，合笼并重新分4组，每组雌鼠和雄鼠各5只（共40只）：第1组（对照组）：雌雄鼠均以正常饵料为食；第2组（实验组1）：雌鼠以正常饵料为食，雄鼠以混合饵料为食；第3组（实验组2）：雌鼠以混合饵料为食，雄鼠以正常饵料为食；第4组（实验组3）：雌雄鼠均以混合饵料为食。合笼后均以正常饵料喂养，观察雌性个体的产仔潜伏期和产仔数量。

采用SPSS 10.0软件对日进食量、脏器系数、生精小管管径、生殖上皮厚度、黄体的大小、产仔潜伏期和产仔数量进行统计学分析，文中数据以平均值±标准差（x±s）表示，根据Non-parametric test，产仔潜伏期和产仔数量为非正态分布，因而用Mann-Whitney U检验，其他为正态分布，用Independent-Samples T检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

雄性实验组日进食量与对照组之间差异无统计学意义（t＝1.360，P＝0.227）；雌性实验组日进食量与对照组比较差异亦无统计学意义（t＝1.170，P＝0.449），见表 1。

表 1 混合饵料对雄雌鼠日进食量的影响（x±s） Table 1 Comparison of mixed chow daily intake for male and female mandarin voles（x±s）

表选项

雄性实验组睾丸脏器系数比对照组明显小（t＝2.740，P＝0.013）；雌性实验组卵巢脏器系数比对照组明显小（t＝3.980，P＝0.001），见表 2。

表 2 混合饵料对雌雄鼠卵巢和睾丸脏器系数的影响（x±s） Table 2 Effect of mixed chow containing castor bean extract on ovarian and testis organ coefficients in experimental mice（x±s）

表选项

光镜下，对照组雄性小鼠睾丸中生精小管管壁完整，生殖上皮厚度较厚，间质中可见单个或成群的间质细胞（图 1A）。实验组生殖上皮厚度较薄，睾丸间质增大，间质细胞较为少见（图 1B）。生精小管管径雄性对照组为（210.26±30.00） μm，实验组为（234.35±42.00） μm，二者差异无统计学意义（t＝1.680，P＝0.075）；生殖上皮厚度雄性对照组为（54.35±7.14） μm，实验组为（26.55±6.11） μm，厚度明显变薄（t＝3.160，P＝0.011）。对照组雌性小白鼠和实验组小白鼠卵巢中发育成熟的卵泡均较多，但实验组黄体萎缩，结构不清。雌性实验组黄体最大横截面积〔（12 347.50±2 359.28）μm²〕明显比对照组〔（19 625.47±6 612.40） μm²〕小，且二者差异有统计学意义（t＝2.750，P＝0.013），见图 1C、D。

图 1 小白鼠睾丸和卵巢组织学切片（HE染色，×125） Figure 1 Histological sections of mice testicle and ovary（HE，×125）

图选项

通过Mann-Whitney U检验与对照组比较，对照组雌性全部怀孕，平均产仔13.50只。实验组1中2只雌鼠怀孕，3只雌鼠未孕，怀孕母鼠潜伏期明显长于对照组，该组平均产仔3.80只，明显少于对照组；实验组2中1只雌鼠怀孕，4只雌鼠未孕，怀孕母鼠潜伏期长于对照组，平均产仔1.80只，明显少于对照组；实验组3中1只雌鼠怀孕，4只雌鼠未孕，怀孕母鼠潜伏期长于对照组，该组平均产仔0.40只，明显少于对照组，见表 3。

表 3 实验组和对照组小白鼠与性成熟雌雄鼠配对后产仔潜伏期及产仔数量（x±s） Table 3 Comparison of the latency of birth and number of offspring after experimental and control groups paired with sexually mature male and female mice（x±s）

表选项

用含蓖麻毒蛋白的混合饵料饲养小白鼠其日进食量与对照组比较差异无统计学意义，表明混合饵料并不影响小白鼠的进食量。这一研究结果与孙媚华等^[5]以生理盐水为溶剂离心去脂后提取的蓖麻粗毒蛋白制备的鼠药适口性结果相一致。食用混合饵料的雄性睾丸脏器系数和雌性卵巢脏器系数明显比对照组小，说明蓖麻籽作用在动物体上一段时间后睾丸和卵巢的相对质量可减小，但质量的减少不仅与药物浓度有关，可能也与适口性有关。

有研究认为蓖麻粗毒蛋白对小白鼠脏器有毒杀作用，可作为植物源灭鼠剂^{[6, 7]}。本实验发现饲喂混合饵料的雄鼠不仅生精小管管径变小，生殖上皮厚度明显变薄，而且无论与饲喂基饵的对照雌鼠还是与饲喂混合饵料的实验雌鼠合笼均明显降低生育率，甚至导致雌性不育，说明蓖麻籽的提取物通过影响睾丸组织结构，有效地抑制雌性小白鼠的生育功能。实验组睾丸中的间质细胞也明显减少，间质细胞的减少与生精小管管径变小，生殖上皮变薄有关，间质细胞是睾丸产生睾酮等性激素的主要来源，睾酮影响精子的产生和发育^[8]。蓖麻籽提取物是否影响精子的产生和发育还有待进一步研究。

本实验发现饲喂混合饵料的雌性实验鼠无论与饲喂基饵的对照雄鼠还是与饲喂混合饵料的实验雄鼠合笼均明显使产仔潜伏期延长，降低生育率，甚至不育。通过制作卵巢组织学切片发现实验组雌性个体卵巢内黄体面积减少，黄体出现萎缩。有研究认为黄体能够分泌雌激素和孕激素，这两种激素对于子宫内膜的周期性变化及受精卵着床、胎儿发育极为重要^[9]。由于激素分泌受到影响，可能导致小鼠动情期延长^[10]，从而使产仔潜伏期延长。蓖麻籽提取物还可改变子宫肌肉层的排列，降低子宫基质层厚度，使黏膜上皮增厚^[10]，还可通过增强小白鼠子宫内部收缩降低着床概率，即在小白鼠子宫内没有着床位点而对小白鼠有抗生育作用^[10]。结合本实验结果，认为蓖麻籽提取物的抗雌鼠生育作用可能是通过多个作用靶点进行的。