全世界啮齿动物有35科389属2 700多种^{[1, 2]}，鼠类既可为人畜共患病的传播媒介，又可为传染源或病原体的宿主，给人类、家畜健康带来严重危害，同时，鼠类还会对农作物造成严重损害^[3]，随着国际贸易和旅游业的发展，鼠类随出入境交通工具、集装箱、货物、行李等进行长距离迁移的机会增多。检验检疫部门一直非常重视输入性鼠类的口岸监测和检疫，已多次在口岸截获输入性鼠类^{[4, 5]}。长期以来，最常用的鼠类鉴定方法仍然是利用形态学上的差异来进行分类鉴定，而形态学鉴定方法受鉴定人员的经验、标本鉴定特征是否完整、鉴定资料是否充足等诸多因素的限制，鉴定人员凭经验或者从检索表中所标明的种类特征进行鉴别，可测量的指标较少，而且一些鼠类的分类地位和进化关系不易确定，易受人为因素的影响。与此同时，形态学鉴定受鼠类不同发育阶段等因素的限制，已远远不能满足其种类鉴定需要，因此，利用分子手段进行鼠类鉴定备受研究者关注。DNA条形码技术是一种应用生物本身所具有的有足够变异且足够保守的标准化短基因片段对物种进行快速、准确鉴定的生物身份识别技术^[6]。本研究通过DNA条形码技术，对2015年4月中山出入境检验检疫局神湾口岸从柬埔寨进口木薯干中截获的2只体形干瘪、形态残缺损坏的鼠类进行种类鉴定，结果确认为褐小家鼠（Mus cervicolor）。经科技查新确定为中国未见分布的鼠种，属口岸首次截获，虽然关于此种的中文资料较少，但郑剑宁和裘炯良^[7]曾描述过此种的形态特征。该研究证实了DNA条形码在鉴定形态残缺的样本或者输入性物种时有明显的优势，弥补了传统形态分类学的不足，同时缓解了口岸检验检疫工作面临业务量大、人员不足、鉴定专家缺乏等诸多难题，在确保检验检疫质量的同时，又能缩短检验检疫周期，提高检验检疫效率。

从柬埔寨进口木薯干中截获的2只鼠类标本，对该标本进行拍照留档，见图 1。标本保存在中山出入境检验检疫局的医学媒介生物标本库中。

图 1 中山口岸截获的形态残损鼠类 Figure 1 Morphologically damaged mouse intercepted at Zhongshan port

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EX-Taq DNA聚合酶、dNTP等PCR试剂购于宝生物工程（大连）有限公司；血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（目录号：DP304-03）、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（目录号：DP210）、pGM-T连接试剂盒（目录号：VT202-02）、上样缓冲液、DNA MarkerⅡ、SYBR GreenⅠ购于天根生化科技有限公司。

取一段鼠尾，按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书指导提取基因组DNA。

扩增COⅠ基因的引物参照文献^[8]，LCO1490：5′-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3′，HCO2198：5′-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3′由宝生物工程（大连）有限公司合成。扩增条件及PCR反应体系参考文献^[9]。

使用TAE缓冲液制作1%的琼脂糖凝胶200 μl，加入5 μl SYBR Green制胶，用2 000 bp DNA Marker作为标准分子质量标记，电压为5 V/cm，电泳30 min凝胶检测。

将PCR产物送上海立菲生物科技有限公司测序。

将序列在NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）网站上进行Blast核酸序列同源性检索，从GenBank中选取与目的片段核苷酸序列同源性较高的及近似属的序列，采用Mega 6.0软件的Kimura-2-parameter模型，构建NJ树。

PCR产物经测序后得到710 bp的碱基序列，去除两端引物后，长度为658 bp。

将2只截获鼠样本的COⅠ序列进行校对分析，无误后进行同源性比对，结果为2只鼠个体间的COⅠ基因序列同源性为99.8%。将序列在NCBI网站上进行Blast核酸序列同源性检索，与基因库中褐小家鼠（Mus cervicolor）的同源性最高为98.5%，差异＜2%，见图 2，符合COⅠ序列在物种内不同个体之间差异＜2%的阈值范围^[10]，故可以认定该截获的鼠类为褐小家鼠。获得的序列去除引物后序列全长为658 bp，将序列提交至NCBI，GenBank Accession号分别为KJ259048和KJ259049。

图 2 截获鼠类的DNA条形码序列在NCBI中的比对结果 Figure 2 Results of the DNA barcoding sequences blasted in the NCBI

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从GenBank中选取与目的片段核苷酸序列同源性较高及近似属的22条序列（表 1），采用Mega 6.0软件的Kimura-2-parameter模型，构建NJ树，见图 3，NJ树上所标数字为置信度。本研究所获得的鼠类序列与GenBank中的小家鼠属中的种类聚为一类，并与褐小家鼠（KJ530559.1）聚为一支，且相似度＞98.5%，置信度高达99.0%，因此可以根据DNA条形码判断所截获鼠类为褐小家鼠。

表 1 截获鼠序列及GenBank中相似性较高鼠序列比较信息 Table 1 Comparation of the sample to its relative species from GenBank

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图 3 基于DNA条形码序列构建的NJ树（Kimura-2-parameter模式） Figure 3 Neighbor⁃joining tree based on the 658 bp DNA barcodes (Kimura-2-parameter model)

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在检验检疫过程中截获的外来鼠类，由于缺乏形态学鉴定资料，特别是对于形态特征已经遭到严重破坏的鼠类个体，很难通过形态特征进行鉴定，给检验检疫工作带来很大困难，DNA条形码技术弥补了这一缺陷。利用DNA条形码技术，本研究通过对截获的鼠样本COⅠ基因与GenBank中基因序列进行同源性比对和聚类分析，结果为截获鼠种与GenBank中褐小家鼠的同源性最高为98.5%，聚类分析结果也进一步证实截获鼠类为褐小家鼠。

委托教育部科技查新站（Z15）暨南大学图书馆查新系统进行国内外中英文资料查询，未查到褐小家鼠在国内分布的相关记录以及有口岸截获的报道，证明本次截获的鼠类为国内口岸首次截获，如果输入性媒介生物在国内存活繁衍，存在与同一生态位本地物种竞争的可能，很可能给生态系统带来一系列危害^[11]，成为人畜共患病的传播媒介、传染源或病原体的储存宿主，给人类、家畜、农作物造成严重损害。

传统的分类学鉴定对鉴定人员专业性、经验性要求很强，培养一个鉴定专家也需要相当长时间的沉淀。而应用DNA条形码技术即使不是专业的人员也能很快熟悉操作流程进行操作，并能对物种进行科学准确的鉴定。随着国际贸易的迅速发展，出入境的人员、货物、交通工具等越来越多，口岸截获外来鼠种类的机会也增多，检验检疫鉴定人员面临的挑战也越来越大，因此，检验检疫部门要进一步提高卫生检疫人员的鉴别能力，尤其是对国内未见分布的输入性媒介生物种类的鉴别能力，防止输入性媒介生物传入我国。近年来，DNA条形码技术已越来越广泛地用于媒介生物的鉴定领域，本研究结果表明DNA条形码可以作为物种鉴定的一种快速、准确、高效的方法，在一定程度上弥补传统形态种类鉴定的不足，为检验检疫的快速通关提供了有利的技术支持。