鼠型斑疹伤寒，又名地方性斑疹伤寒(Endemic typhus)，是由莫氏立克次体〔又称斑疹伤寒立克次体(Rickettsia typhi)〕引起的一种人畜共患自然疫源性急性传染病^[1]。鼠作为鼠型斑疹伤寒最主要传播媒介，经破损皮肤感染和进食病鼠排泄物污染的饮食可作为人类染病的主要传播方式，其次干蚤粪内的病原体偶可成为气溶胶，经呼吸道或眼结膜而使人受染^[2]。主要临床症状与流行性斑疹伤寒相似，并发症以支气管炎最多见，其他并发症有肾功能衰竭^{[3, 4]}。自1931年我国在东北首次检测到莫氏立克次体以来，迄今已有19个省(直辖市、自治区)对鼠型斑疹伤寒进行报道，其中河北、辽宁省始终保持较高的发病状况，而江苏省、上海市发病例数一直较低，但该病误诊漏诊率较高^{[5, 6]}。

黑瞎子岛位于黑龙江省抚远县境内，是继香港、澳门之后，第三块回归到祖国的领土。地理方位为北纬48°17′～48°27′，东经 134°24′～135°05′，2008年根据中俄边境勘定协定，划归中国的领土面积为174 km2^[7]。它扼守着黑龙江——乌苏里江通航的咽喉，隔江与俄罗斯东部最大城市哈巴罗夫斯克相望，是处于重要战略地位的地区。该岛生境为灌木丛、荒草地和林地，基本处于尚未开发阶段^[8]，岛上设施匮乏，尚未开展大量媒介病原体调查，因此有必要了解斑疹伤寒立克次体在该岛的流行状况，为科学开发黑瞎子岛提供理论基础，同时也为口岸开发保障工作提供决策依据。

于2013年4－7月(因黑瞎子岛地区被淹，故8－9月未能采集样品)、10月和2014年4－10月在黑瞎子岛的不同生境(灌木丛、荒草地和林地)，采用夹夜法捕鼠，以花生米为诱饵，间隔5 m布放1夹，晚放晨收，每月集中捕鼠一次。将捕获鼠放入鼠袋并用乙醚熏蒸15～30 min，现场鉴定鼠种、性别后，记录鼠的外观形态，无菌取其肝脏，放入冻存管内置于液氮中保存运送至实验室待检。

血液与组织核酸提取试剂盒(Blood＆Tissue Kit，德国QIAGEN公司)；PCR反应体系及DNA聚合酶(大连TaKaRa公司)；9700 PCR扩增仪(美国ABI公司)；琼脂糖凝胶电泳仪及电泳槽(伯乐公司)；Gel logic 212PRO凝胶成像分析系统(Carestream Health)；NU-430/600E生物安全柜(美国NUAIRE公司)。

研磨鼠的肝脏至匀浆，取研磨液上清200 μl，按照QIAGEN公司组织提取试剂盒的操作说明提取肝脏总DNA。采用巢式PCR方法扩增斑疹伤寒立克次体gltA基因的136 bp特异性片段^[9]。反应总体系为50 μl，扩增体系包括1 μl DNA模板、0.5 μmol/L MgCl₂、0.2 μmol/L dNTPs、每对引物(表 1)1 μmol/L和1 U的rTaq 聚合酶，其余用ddH2O补足体系。第一轮反应以DNA为模板，程序为95 ℃预变性5 min；94 ℃ 变性30 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，共35个循环，最后72 ℃ 延伸10 min。第二轮反应以第一轮PCR产物为模板，程序为95 ℃预变性5 min；94 ℃ 变性30 s，56 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。用带有GoodView的1.5%琼脂糖凝胶电泳PCR产物。为避免污染，DNA提取，反应体系配置，模板添加，扩增以及琼脂糖电泳分别在不同区域进行，各区域配有专用的加样器，并定期紫外照射。

表 1 斑疹伤寒立克次体检测引物 Table 1 The primers for the detection of R.typhi

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将阳性扩增产物送上海英骏生物技术有限公司测序，将测得的序列运用GenBank中Blast软件进行比对分析，从获得的序列中，选取有代表性的并有差异的序列进行系统发育树分析，运用DNAStar软件构建系统发育树，综合比较斑疹伤寒立克次体菌株系统进化树，用Clustal法进行同源性分析。

运用Excel软件对数据录入并整理，应用SPSS 19.0软件包进行数据分析，采用单因素χ²检验、Fisher确切概率或one-way ANOVA分析，分别探讨性别、体重、捕鼠月份和鼠种与斑疹伤寒立克次体感染之间的关系； P＜0.05为差异有统计学意义。采用非条件logistic 回归分析模型进行多因素对鼠感染斑疹伤寒立克次体影响的分析。

2013－2014年共捕获鼠形动物644只，隶属啮齿目3科6属，食虫目1科1属和食肉目1科1属，其中黑线姬鼠(Apodemus agrarius)为黑瞎子岛地区的优势鼠种，占捕获总数的42.70%(275/644)，其次为红背鼠平(Clethrionomys rutilus)和东方田鼠(Microtus fortis)，分别占27.64%(178/644)和21.12%(136/644)(表 2)。

表 2 黑瞎子岛地区不同生境、不同年份鼠形动物种群构成比(%) Table 2 The population composition ratio of rodents on Heixiazi Island in different habitats and different years (%)

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共检出31只鼠感染斑疹伤寒，阳性率为4.81%。分属于啮齿目中的5种鼠，经Fisher确切概率分析，尚不能认为不同鼠种间斑疹伤寒感染率差异有统计学意义(P=0.156)(表 3)。经单因素χ2检验分析，雌鼠感染率(10/168，5.95%)虽高于雄鼠感染率(21/476，4.41%)，但差异无统计学意义(χ²=0.643，P=0.423)；经one?way ANOVA分析，斑疹伤寒感染组体重均值(38.2548 g)与非感染组的体重均值(32.2271 g)差异无统计学意义(F=1.633，P=0.202)；不同捕鼠时间鼠斑疹伤寒感染率差异有统计学意义(χ²=191.419，P=0.000)(表 4)。

表 3 黑瞎子岛地区不同鼠形动物间斑疹伤寒感染状况 Table 3 The infection of R.typhi in different species of rodents on Heixiazi Island

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表 4 黑瞎子岛地区捕鼠时间与斑疹伤寒感染状况 Table 4 The infection of R.typhi in different months of capture on Heixiazi Island

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捕鼠月份、鼠种、性别和体重作为协变量，其中多分类变量(捕鼠月份和鼠种)设置参照标准，斑疹伤寒的感染状况作为因变量，进行非条件logistic回归分析。结果表明，模型^χ2=116.559，P=0.000，可认为拟合的方程有统计学意义。以黑线姬鼠为参照水平与其他鼠形动物进行分析，不同鼠形动物与斑疹伤寒立克次体的感染不存在显著性相关。性别、体重不是鼠斑疹伤寒立克次体感染的影响因素(P＞0.05)。但在此模型中，以2013年4月为参照水平与其他捕鼠月份进行分析，不同捕鼠月份是鼠斑疹伤寒立克次体感染的影响因素(P=0.026)。

本研究中阳性样本的基因序列几乎相同，其中有7个具有代表性的序列，用DNAStar软件对这7条基因序列中gltA基因的136 bp片段序列进行比对，发现其同源性为99.98%～100%，变异度较小，进化程度较为相近(图 1)。图 2显示出黑瞎子岛中斑疹伤寒立克次体的不同氨基酸序列。通过Mega 5.0软件构建NJ进化树，感染斑疹伤寒立克次体在同一进化支上，且与美国菌株CP003398在进化上最为接近，相似度＞95.83%(图 3)。

图 1 黑瞎子岛地区斑疹伤寒立克次体的7个核苷酸序列同源性分析 Figure 1 Identities of the 7 nucleic acid sequences of R.typhi isolated on Heixiazi Island

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图 2 黑瞎子岛地区斑疹伤寒立克次体菌株核苷酸序列与美国菌株CP003398的比较 Figure 2 The variation of nucleic acid sequences of the isolated strains of R.typhi on Heixiazi Island compared with the strain CP003398(USA)

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注:B1、B2、ban1、ban3、ban5、ban7和ban8为黑瞎子岛代表菌株。 图 3 黑瞎子岛地区斑疹伤寒立克次体及比较菌株系统发育树 Figure 3 The phylogenetic tree between R.typhi strains and other strains on Heixiazi Island

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斑疹伤寒立克次体是鼠型斑疹伤寒的致病病原体，由于鼠型斑疹伤寒的临床非特异症状，使得它在临床诊断上常常发生误诊、漏报的现象。该病分布在全球范围内，但以热带、亚热带及温带地区较多^[10]。在我国分布也相当广泛，在东北、华北以及南方地区均有分布。在人口密集、居住环境差、鼠害严重等地区的发病率较高，全年均有病例发生，但以夏季和秋季为主，人群普遍易感。因此，对于分布较为广泛的鼠型斑疹伤寒，对人类及畜牧危害极大。

黑瞎子岛生境较为单一，但鼠形动物的种类存在多样性，以黑线姬鼠和红背鼠平为优势种，这一结果与以往中俄边境鼠形动物的调查结果相吻合^{[11, 12]}。但是经过2年的连续调查，2013年因黑瞎子岛在8－9月被洪水淹没未能采集样本，使得2013年的数据不够完整，与2014年连续7个月的调查有一定差异，2013年该岛红背鼠平较黑线姬鼠为优势鼠种，但在2014年的调查中发现黑线姬鼠较红背鼠平为优势鼠种，这一结果与2011年对黑瞎子岛的全年监测结果有差异^[13]，可能与黑瞎子岛被洪水淹没鼠种构成发生变化有关。

在本次调查中发现，斑疹伤寒立克次体感染的主要危险因素仅为捕鼠时间，其他因素如性别、体重及鼠种，在统计学上尚不能认为是斑疹伤寒立克次体感染的影响因素。捕鼠时间与斑疹伤寒立克次体的感染有相关性，可能与季节有关，但在2013年10月前尚未检测到斑疹伤寒立克次体的感染，从10月开始逐渐有斑疹伤寒立克次体的感染，可能与黑瞎子岛8－9月被洪水淹过有关，此点有待进一步研究。虽然在统计学上尚不能认为鼠种与斑疹伤寒立克次体感染有关，但据以往报道褐家鼠(Rattus norvegicus)和黄胸鼠(R. tanezumi)为斑疹伤寒立克次体的主要贮存宿主^[14]，在本次调查中发现东方田鼠对斑疹伤寒立克次体有较高的感染率，其次为褐家鼠，可能与黑瞎子岛的原始生境，以及东方田鼠较褐家鼠的捕获基数大有关，另外也可能与黑瞎子岛2013年被淹生境发生变化有关。

通过对斑疹伤寒立克次体的系统发育分析可知，黑瞎子岛地区斑疹伤寒立克次体同属于一个进化支，菌株之间差异性不大，表明该地区斑疹伤寒立克次体在系统发育上相似并成簇。与国内外其他菌株相比较可知，美国菌株CP003398与黑瞎子岛地区检测出的菌株在遗传进化上最为相近，但仍存在一定差异。

由于黑瞎子岛处于特殊的地理位置，以及刚刚回归，逐渐会有越来越多的人群在黑瞎子岛地区流动。因此，对于斑疹伤寒立克次体在该岛的感染状况进行流行病学调查很有必要，人群对斑疹伤寒立克次体的普遍易感^[15]，也使得对该岛病原体的调查有待更进一步研究，为保障居民健康及进一步科学开发黑瞎子岛提供依据。