西尼罗病毒（West Nile virus，WNV）为单链RNA病毒，与流行性乙型脑炎、登革热病毒同属虫媒病毒黄病毒科黄病毒属，广泛分布于非洲、中东和西亚，主要引起西尼罗热（West Nile fever，WNF）^[1]。病毒感染者主要有发热、肌肉疼痛等类似感冒的症状，其中有小部分人会出现脑炎和脊髓炎甚至导致死亡。近年来，WNF流行的范围不断扩大，流行强度逐渐增强^[2]。WNV的主要宿主是鸟类，主要传播媒介是蚊虫，可在蚊和鸟体内越冬，也可经输血、器官移植传播和母婴传播。WNV媒介蚊种的范围非常广泛，目前已从至少75 种蚊虫中检测到WNV，库蚊是最主要的媒介，尖音库蚊（Culex pipiens）是很重要的传播媒介^{[3, 4]}，虽然我国尚未发现WNV感染的临床病例，但随着国际交流的日益频繁，人员流动，WNV传入我国境内的可能性非常大^[5]。广东省城镇的优势蚊种包括致乏库蚊 / 致倦库蚊（Cx. pipiens quinquefasciatus）、白纹伊蚊（Aedes albopictus）、三带喙库蚊（Cx. tritaeniorhynchus）等，具备WNF的传播条件，可能由输入的病毒感染而引起本地暴发流行。近年来，由于旅游输入病毒感染者，广东省发生了全国基孔肯雅热的首次暴发流行^[6]。因此，开展WNV传播媒介的研究对预防WNV在广东省的暴发流行非常重要。

在广东省的广州、佛山、东莞、茂名市的城区和郊区设点，城区选择居民区、公园（含街心公园）、医院等各3处，郊区选择民房和牲畜棚（牛棚和猪圈等）等各3处，进行成蚊密度监测。

成蚊密度监测采用诱蚊灯法，每月监测1次，监测时间从16：00至次日09：00。第2天将集蚊盒取出，鉴定计数，统计蚊虫密度并收集成蚊样品；在蚊虫的密度高峰期5－11月每月采用灭蚊磁收集蚊虫样品进行WNV的PCR检测，布放时间从16：00至次日10：00。诱蚊灯和灭蚊磁收集到的样品按时间、地点和蚊种分类保存于-80 ℃超低温冰箱。

在新鲜配制的90 ml MEM中加入2 ml小牛血清、100 μl庆大霉素（50 μg/ml）、1 ml两性霉素B（1000 μg/ml）和1 ml青链霉素（1000 U/ml），用7.5%碳酸氢钠溶液调至pH 7.2。

在冰上操作。于1只1.5 ml的Eppendorf离心管中加入100 μl标本处理液，将要研磨的蚊标本（4～25只）放进离心管中，用小型电动研磨器将蚊虫磨匀，补加900 μl标本处理液，置预冷4 ℃的离心机上，10 730×g离心10 min。取上清液进行核酸提取或接种组织细胞。剩余的研磨标本液需保存在-80 ℃超低温冰箱中以备复查。

按照QIAamp Viral RNA Kit的说明从蚊标本研磨液中提取病毒RNA，得到的RNA即可进行反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测。

按Invitrogen Superscript^TM Ⅲ One-Step RT-PCR System with Platinum^® Taq DNA Ploymerase试剂盒提供的方法进行。引物序列为WN233 5′-TTG TGT TGG CTC TCT TGG CGT TCT T-3′，WN640 5′-CAG CCG ACA GCA CTG GAC ATT CAT A-3′，反应体系：2×Reactin Mix 12.5 μl，SuperScriptTmⅢ RT/Platinum^® Taq Mix 1.0 μl，Prime-F （10 μmol/L） 0.5 μl，Prime-R（10 μmol/L） 0.5 μl，RNA 7.5 μl，加无菌水至总体积25 μl。每个反应包括反转录和PCR扩增两个部分，具体反应条件： 50 ℃反转录30 min，94 ℃去活反转录酶AMV 2 min，同时激活PCR Tap聚合酶，然后进入PCR循环扩增阶段（循环数为40次，94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，每一循环72 ℃延伸时间增加1 s），最后再72 ℃延伸10 min。

用2%的琼脂糖进行电泳分离，EB染色30 min后于紫外透射仪上观察、照相。2%琼脂糖电泳所得WNV的目标片段为408 bp。

2013年5月至2014年4月广州、佛山、东莞、茂名市各监测点布放的诱蚊灯共捕获蚊类38 968只，雄雌比为0.88∶1。其中捕获致乏库蚊/致倦库蚊35 032只，占捕获蚊虫总数的89.90%；白纹伊蚊3015只，占7.74%；其他依次为三带喙库蚊、中华按蚊（Anopheles sinensis）、微小按蚊（An. minimus）、埃及伊蚊（Ae. aegypti）和雷氏按蚊（An. lesteri）等（表1）。平均密度为11.80只/灯，5月蚊密度最高，2、3月蚊密度最低（图1）。

表 1 2013年5月至2014年4月广东省蚊虫密度诱蚊灯监测结果 Table 1 Result of mosquito density surveillance by mosquito-trap（Guangdong May 2013-Apr 2014）

表选项

图 1 2013年5月至2014年4月广东省蚊虫密度消长 Figure 1 Density fluctuation of mosquitoes in different environments（Guangdong May 2013-Apr 2014）

图选项

居民区、公园、医院、农户、牲畜棚5类环境的有效布灯数分别为1383、539、783、215和165盏。从环境类型来看，牲畜棚蚊密度最高，平均为31.94只/灯，其次为公园、农户和居民区，4年平均分别为16.60、15.72和9.29只/灯，医院为7.14只/灯（图2）。

图 2 2013年5月至2014年4月广东省不同生境蚊虫密度季节消长 Figure 2 Density fluctuation diagram of mosquitosin different environments（Guangdong May 2013-Apr 2014）

图选项

各类监测生境蚊虫密度基本上呈单峰曲线，高峰期在4－6月（图2），均未在9－10月呈现1个次高峰。

2013年5－11月每月在每个监测点布放灭蚊磁3台，共捕获蚊虫3052只，雌雄比为0.90∶1，其中致乏库蚊/致倦库蚊2638只，占捕获总数的86.44%，白纹伊蚊占7.24%（221/3052），三带喙库蚊占3.57%（109/3052），中华按蚊占2.10%（64/3052），埃及伊蚊占0.65%（20/3052）。

对2013年5月至2014年4月在广州、佛山、东莞、茂名市采集到的蚊类按时间、地点、采集方法和蚊种分为295份，每份4～25只，共5000多只蚊样品经过RT-PCR检测，其中诱蚊灯采集蚊虫2000多只，灭蚊磁采集蚊虫3000多只，致乏库蚊/致倦库蚊215份，白纹伊蚊30份，三带喙库蚊30份，埃及伊蚊和中华按蚊各10份，均未发现WNV阳性（图3）。

注：1. 阴性对照；2、3. 蚊样品；4. 阳性对照；M. Marker。 图 3 RT-PCR产物（2%琼脂糖凝胶电泳） Figure 3 Results of RT-PCR by 2% agarose gel electrophoresis

图选项

本次监测结果显示，广东省主要优势蚊种为致乏库蚊/致倦库蚊，白纹伊蚊仅占7.74%，与2006－2012年调查结果一致。事实上广东省的伊蚊与致乏库蚊/致倦库蚊均为本地优势蚊种，因伊蚊为白天活动蚊虫，诱蚊灯不适于监测伊蚊密度，伊蚊密度控制应根据布雷图指数和诱蚊诱卵指数等专项监测结果^[7]。

目前WNV的传播蚊媒涵盖了库蚊属、伊蚊属等世界性分布的主要蚊种，如尖音库蚊、淡色库蚊、致乏库蚊/致倦库蚊、三带喙库蚊、白纹伊蚊、刺扰伊蚊（Ae. vexans）、埃及伊蚊等，其中有20 余种传播WNV 的蚊种在我国大量存在^[8]。广东省每年均可监测到大量传播WNV 的主要蚊种致乏库蚊/致倦库蚊、白纹伊蚊和三带喙库蚊等，为预防WNV在广东省的传播流行，必须加强对其潜在传播媒介的监测。致乏库蚊/致倦库蚊是广东省的优势蚊种，加强监测可以掌握其消长规律，为制定适宜的防制措施及预报预警其可能传播的WNV提供科学依据。

PCR是分子生物技术实验室中的首选方法之一，具有简便、安全、快速、灵敏、特异性强等特点，近几年在媒介生物学研究中具有重要的应用价值^[9]。2013年5月至2014年4月，利用诱蚊灯和灭蚊磁采集广东省内的蚊虫进行WNV的特异性RT-PCR检测，未发现阳性，与浙江省、广东省从化等地的检查结果相一致^{[5, 10]}。近年来广东省也未出现输入病例，目前认为WNF在广东省的传播风险比较低。但广东省存在传播的媒介基础，随着国际交往的不断增多，一旦有输入病例则存在WNF流行的风险。重点应关注蚊媒密度的高峰季节4－6月和可能的次高峰9－10月。由于检测方法和样品数量等的局限性，对WNV的携带情况调查也有一定的局限性，有关广东省内的WNF的传播媒介种类及传播效能、流行风险等有待进一步深入研究。