蚊虫作为一类重要的医学昆虫，能传播疟疾、流行性乙型脑炎（乙脑）、登革热和丝虫病等多种虫媒传染病^[1]，媒介研究是蚊媒病流行病学研究和预防控制的首要工作之一。淡色库蚊（Culex pipiens pallens）是我国重要的吸血骚扰性蚊虫，在北方地区分布广泛，是乙脑和丝虫病的重要传播媒介。不同的蚊媒种群对于病原体的传播具有种属特异性，进而影响其流行病学特征，对蚊媒种属进行遗传变异研究和分子鉴别对于蚊媒疾病的防治具有重要意义。多拷贝的核糖体DNA是在蚊虫近缘种的鉴别和系统关系分析中应用较为成功和理想的分类指标。研究表明，蚊虫rDNA单位有18S、5.8S、28S RNA编码区、基因间隔区（ICS）、第1和第2转录间隔区（ITSl、ITS2 ）、外转录间隔区（EST）组成，编码区的序列高度保守，间隔区的序列存在种间差异，其中ITS区不加入成熟核糖体，受到选择压力小，进化的速率较快，因此可以从其序列中得到较多的信息^[2]。本实验根据核糖体DNA第二内转录间隔区（rDNA-ITS2）基因特点设计特异性引物，PCR扩增获得山东省不同地区不同地理环境下淡色库蚊的ITS2基因序列特征，探讨不同群体ITS2的基因分化及遗传差异，为山东省蚊媒监测及疾病防治工作提供依据。

分别在济南（AJN）、济宁（JN）、青岛（QD）、聊城（LC）、临沂（LY）、淄博（ZB）以及南京（NJ）现场采集淡色库蚊雌蚊，实验室选育的抗敌敌畏（DDV）和抗氯氰菊酯品系（Pyr）淡色库蚊常规饲养。

dNTP、LA Taq聚合酶、pMD19-T Vector试剂盒、大肠埃希菌感受态细胞Escherichia coli JM109、DNA分子质量标准（DL-2000、1 kp Ladder）、T4 DNA连接酶均购自TaKaRa公司；质粒小提试剂盒和凝胶回收试剂盒购于Axygen公司；其余试剂为国产分析纯。T Gradient Thermoblock PCR扩增仪（Biometra），Mini-Protean Tetra Cell电泳仪（Bio-Rad），Smart Spec3000紫外分光光度计（Bio-Rad）。

按文献[3]操作步骤，提取单蚊基因组DNA，具体步骤： 裂解液（NaCl 0.467 g，EDTA 2.233 g，SDS 0.5 g，Tris-HCl 1.121 g，蔗糖5.476 g，加H₂O至100 ml），65 ℃预热。单个蚊虫置于1.5 ml离心管中，加入100 μl预热的裂解液，用塑料研磨棒研磨至匀浆状。65 ℃孵育30 min。加5 mol/L（25 μl）乙酸钾至终浓度1 mol/L，混匀。4 ℃置30 min。13 200 r/min（离心半径10 cm）离心10 min。取上清液，可抽取100～110 μl上清液，不抽沉淀。加2～2.5倍体积预冷无水乙醇（-20 ℃）沉淀核酸。4 ℃静置30 min至3 h。13 200 r/min （离心半径10 cm）离心10 min。弃上清液，加75%乙醇200～300 μl（-4 ℃） 洗涤盐分；弃上清液，37 ℃烘干。加50～100 μl双蒸灭菌水溶解，置-20 ℃冰箱保存待用。紫外分光光度计测DNA浓度及纯度，1%琼脂糖凝胶电泳分析。

根据蚊虫rDNA-ITS2序列特征，在相对保守区域设计引物，引物由上海Invitrogen贸易有限公司合成。上游引物：5′- GGG GTA GTC ACA CAT TAT TTG AGG-3′，与淡色库蚊5.8S末端编码区保守序列互补；下游引物：5′-GAA CTG CAG GAC ACA TGA ACA CCG-3′，与淡色库蚊28S前端编码区保守序列互补。以提取的DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增。采用50 μl反应体系：ddH2O 38.5 μl、10×LA PCR Buffer 5 μl、10 mmol/L dNTP 1 μl、模板DNA 1 μl、LA Taq聚合酶0.5 μl、10 pmol/L上下游引物各2 μl。反应条件：94 ℃预变性3 min； 94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1min，共30个循环；最后72 ℃延伸5 min。取扩增产物1 μl进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。

用DNA片段纯化/回收试剂盒对目的DNA片段进行纯化，将纯化后的基因片段连接到pMD-19T simple Vector上，然后转化至大肠埃希菌感受态细胞E. coli JM109，并将转化菌涂布到含有氨苄西林的LB固体培养平板上，37 ℃培养过夜，挑取单菌落进行菌体PCR鉴定，阳性克隆摇菌培养并送Invitrogen公司测序。不同个体淡色库蚊rDNA-ITS2序列用DNAman软件进行序列比对，用ClustalX 1.81和Mega 4.0软件分析不同个体间的基因多态性和构建系统进化树。

以提取的6个不同地区淡色库蚊及实验室培养株的DNA为模板，PCR扩增得到rDNA-ITS2基因片段，1%琼脂糖凝胶电泳结果表明，在500 bp左右可观察到与预期分子质量大小相符的DNA条带（图1）。

注：M. DNA 分子质量标准（DL-2000）；1～6. 济南、济宁、青岛、 淄博、临沂、聊城市蚊虫rDNA⁃ITS2 PCR产物。 图 1 淡色库蚊rDNA-ITS2基因PCR产物电泳结果 Figure 1 Analysis of PCR amplified rDNA-ITS2 genes of Cx. pipiens pallens

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将纯化的PCR产物与pMD-19T simple Vector连接并转化E. coli JM109，37 ℃过夜培养后挑选单菌落进行PCR鉴定阳性克隆，1%琼脂糖凝胶电泳分析（图2），其中在500 bp左右出现DNA条带的为阳性克隆。

注：M. DNA 分子质量标准（DL-2000）；1～20. 不同菌落的PCR 鉴定结果。 图 2 菌落PCR的琼脂糖凝胶电泳分析 Figure 2 Analysis of colony PCR

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测序结果发现9个克隆有9种序列类型，长度为460 bp左右。通过序列比对可以看出这些不同地区的淡色库蚊rDNA-ITS2基因序列存在着多态性（图3），淡色库蚊rDNA-ITS2出现36个变异位点，变异率为7.83%。rDNA-ITS2 基因单核苷酸存在转换、颠换和缺失，其中7处出现转换，包括4次A-G转换，3次T-C转换；4处出现颠换，包括1次T-G颠换，2次T-A颠换，1次C-G颠换；25处存在单核苷酸缺失（表1）。系统进化分析表明，山东省不同采样点淡色库蚊rDNA-ITS2基因存在不同分支，遗传距离存在差异，与实验室不同抗性品系rDNA-ITS2基因之间的遗传距离也存在差异，济南和济宁市聚成一类，聊城和淄博市聚成一类，青岛、临沂与南京市各为相对独立的一支，而抗DDV抗性和抗氯氰菊酯抗性的淡色库蚊和临沂地区淡色库蚊最为相近，是另外独立的一支（图4）。

图 3 淡色库蚊rDNA-ITS2基因序列比对结果 Figure 3 Sequence alignment of Cx. pipiens pallens rDNA-ITS2 · 553 ·

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表 1 淡色库蚊rDNA-ITS2基因序列位点变异 Table 1 The mutation sites of rDNA-ITS2 gene sequences of Cx. pipiens pallens

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图 4 山东省不同地区淡色库蚊rDNA-ITS2系统发育进化树 Figure 4 Phylogenetic analysis of Cx. pipiens pallens from different areas in Shandong province

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在蚊虫分类中，长期以来都是以形态特征作为分类依据，然而许多复合体的相继发现和亲缘种的存在，使得单纯的形态分类学无法对其进行鉴别。它们虽然外部形态相似，但其生态习性、分布区域和媒介效能等却可能有很大差异，并能影响其流行病学特征。因此，在难以用传统的形态学鉴别手段区分形态接近的蚊虫情况下，寻找新的有效方法对其进行正确鉴别具有重要的流行病学意义。随着分子生物学技术的迅猛发展，出现了线粒体DNA、核糖体DNA、微卫星DNA、单核苷酸多态性（SNP）和限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性（RAPD）等多种分子遗传标记。越来越多的研究人员使用分子生物和生物信息学方法鉴别蚊虫种群，并取得较好研究成果^{[4, 5, 6, 7]}。山东省位于中国东部沿海、黄河下游，属暖温带季风气候类型，有多种蚊类孳生繁殖^[8]。淡色库蚊是主要的蚊种，是丝虫病和乙脑的重要传播媒介，严重危害人类健康。充分运用分子生物学技术获得遗传信息，探索山东省蚊虫种群内的基因鉴别标志，对于深入了解媒介遗传多样性、媒介对病原体的易感性具有重要意义。

在蚊虫近缘种的鉴别和系统关系分析中应用较为理想的分类指标是多拷贝的核糖体DNA。rDNA-ITS2序列差异在种内高度保守，这一基因家族通过不等交换（unequal crossingover）和基因转换（gene conversion）经历快速的协同进化导致了重复单位在基因组中的一致性。rDNA-ITS2在生物界存在的普遍性、多拷贝性，在个体和群体内具有较好的均一性、少量样本能有效代表群体的变异情况等优点，很多学者将其作为生物系统进化研究的一个非常有用的分子标志^{[9, 10, 11, 12]}。目前，蚊虫复合体成员种分子鉴别研究中应用rDNA作为分类指标较多，大多数以ITS2为依据^[13]。

本研究以山东省不同地区的淡色库蚊和实验室培养株为材料，设计rDNA-ITS2特异性引物，提取单蚊DNA，采用PCR方法获得rDNA-ITS2基因序列并进行序列分析。该方法虽简便快捷，但需要提取合格的蚊虫DNA，严格控制反应条件并精确测序。结果显示不同地区的淡色库蚊出现单核苷酸多态性，rDNA-ITS2基因变异率为7.83%，存在单核苷酸转换、颠换和缺失，缺失频率最高，转换频率高于颠换频率。变异位点均位于ITS2基因区，两侧的基因高度保守。不同地区淡色库蚊的rDNA-ITS2基因存在差异性，与实验室两个抗性品系之间也有较明显差异。这些差异与淡色库蚊对病原体易感性之间的关系有待于进一步研究。从生物进化树图中可以看出共形成两大分支，济南和济宁市的淡色库蚊遗传关系相近，聊城与淄博市的淡色库蚊遗传关系相近，青岛、临沂与南京市为相对独立的一支，这种基因的多态性可能与地域差异造成的生态环境以及人群活动和城市建设有关。抗DDV抗性和抗氯氰菊酯抗性的淡色库蚊来源于同一个分支，与两种抗性品系来源于同一种敏感品系的选育相符合，杀虫剂的选择压力使蚊虫向两个方向进化。二者和临沂地区淡色库蚊最为相近，可以预测其来源的敏感品系淡色库蚊可能与临沂地区的淡色库蚊遗传关系相近。