人粒细胞无形体病（HGA）、人单核细胞埃立克体病（HME）和斑点热病（SF）是由蜱传播的立克次体病，其病原体分别为粒细胞无形体（Anaplasma phagocytophilum，Ap）、查菲埃立克体（Ehrlichia chaffeensis，Ec）及斑点热立克次体（Spotted fever group rickettsia，SFGR）。斑点热在我国早已证实，而HGA和HME为近年新发现的蜱媒疾病，目前研究证明Ap和Ec感染已遍布美国、欧洲及亚洲日本、韩国等。特别在美国，2007－2008年缅因州无形体病报告病例数增长接近2倍，埃立克体病病例数接近4倍，已成为常见的危及生命的蜱媒病^{[1, 2, 3]}。我国自安徽省（2006年）出现HGA病例并发生院内传播以来^[4]，HGA和HME的研究备受重视，分子流行病学和病原学证实我国安徽、山东、浙江、新疆等省（自治区）家养动物和野生啮齿动物存在Ap和Ec感染^{[5, 6]}，HGA和HME确诊病例主要分布在河北、山东、河南省及北京、天津市^[7]。

野生啮齿动物和家养动物可能是HGA和HME的宿主，蜱是媒介，蜱媒病原体在蜱和野生啮齿动物间维持持久的感染循环，人类和家养动物接触到这个环链发生感染。由于蜱主要寄生于野生动物，这些动物可能是很多病原体的宿主^{[3, 5]}，因此研究其自然感染状况和特点可为疾病流行的预测及疫源地确定提供科学依据。2012年，我们在东北地区辽宁省宽甸和吉林省集安林区选点捕鼠，采用PCR方法扩增无形体与埃立克体16S rRNA基因和斑点热立克次体ompA基因，调查野鼠几种立克次体感染和复合感染情况，结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 材料

野鼠标本系从吉林省集安、辽宁省宽甸（2012年）针阔混交林区和林缘耕地，采用夹夜法和笼夜法捕获。用白布袋将捕获野鼠装袋后带回现场实验室进行鼠种分类鉴定，无菌操作取脾脏，置于细胞管内，液氮保存。 1.2 方法 1.2.1 鼠脾标本DNA提取

取鼠脾约30 mg，应用DNeasy Blood ＆Tissue Kit（QIAGEN）按说明书操作提取DNA，DNA提取液置-20 ℃保存备用。 1.2.2 PCR扩增

用巢式PCR扩增无形体属和埃立克体属16S rRNA基因^[6]，HGA和HME的第一轮PCR采用通用外引物out1（5′-TTG AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG-3′）和out2（5′-CAC CTC TAC ACT AGG AAT TCC GCT ATC-3′），第二轮PCR分别采用无形体属特异分型引物 HGA1（5′-GTC GAA CGG ATT ATT CTT TAT AGC TTG-3′）和HGA2（5′-TAT AGG TAC CGT CAT TAT CTT CCC TAC-3′）；埃立克体属特异分型引物 HME1（5′- CAA TTG CTT ATA ACC TTT TGG TTA TAA AT-3′）和HME2（5′-TAT AGG TAC CGT CAT TAT CTT CCC TAT-3′）。反应体系：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火50 s，72℃延伸1 min，共40个循环，最后72 ℃总延伸5 min。取第一轮产物1 μl为模板进行第二轮扩增，两次扩增反应体系相同。最终扩增产物目的片段大小为380 bp。

SFGR以外膜蛋白A基因（ompA）按文献^[2]设计引物和PCR扩增。引物序列：Rr190.70p（ATG GCG AAT ATT TCT CCA AAA）和Rr190.701n（GTT CCG TTA ATG GCA GCA TCT）。扩增产物目的片段大小为603 bp。 1.2.3 统计学处理

应用SPSS软件进行统计学分析，率的比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 PCR检测及复合感染

对集安和宽甸两地132份野鼠标本分别进行3种病原体的PCR检测（表 1），结果表明埃立克体、无形体和SFGR的感染率分别为14.39%、6.06%和10.61%。其中，集安66份野鼠标本埃立克体、无形体和SFGR的阳性率均为7.58%，三者感染率相同。宽甸66份野鼠标本中，埃立克体、无形体和SFGR的阳性率分别为21.21%、4.55%和13.64%，埃立克体感染率明显高于无形体和SFGR（χ²＝8.058，P＝0.018）。宽甸野鼠立克次体感染以埃立克体为主，明显高于集安（χ²＝3.935，P＝0.047）。

表 1 不同地区野鼠中3种蜱媒立克次体的阳性率及复合感染率 Table 1 Infection rates and co?infection rates for 3 tick?borne agents in rodents

表选项

在132份野鼠标本中，埃立克体与无形体复合感染标本2份（1.52%），埃立克体与SFGR复合感染标本3份（2.27%），复合感染率为3.79%，未发现无形体与SFGR复合感染（表 1）。 2.2 不同鼠种PCR检测及复合感染

对集安和宽甸两地捕获的野鼠进行分类鉴定，132只野鼠中有5个种，分别为黑线姬鼠（Apodemus agrarius） （87只，65.91%）、林姬鼠（A. sylvaticus）（25只，18.94%）、大仓鼠（Tscherskia triton）（15只，11.36%）、褐家鼠（Rattus norvegicus）（4只，3.03%）和鼩鼱（Sorex araneus）（1只，0.76%）。黑线姬鼠和林姬鼠为优势鼠种，占捕获总数的84.85%（表 2）。

表 2 调查地区不同鼠种3种蜱媒立克次体的PCR检测结果 Table 2 Results of PCR analysis for 3 tick?borne agents in different rodent species

表选项

PCR检测结果表明，从黑线姬鼠检出阳性：埃立克体12份（13.79%），无形体6份（6.90%），SFGR 12 份（13.79%）；从林姬鼠检出阳性：埃立克体5份 （20.00%），无形体1份（4.00%），SFGR 2份（8.00%）。从大仓鼠中仅检出埃立克体阳性1份（6.67%），褐家鼠为阴性。而从唯一的1份鼩鼱标本中同时检测到埃立克体和无形体。不同鼠种对不同病原体的检出阳性率虽然有差别，但差异无统计学意义。

从不同鼠种共检出复合感染标本5份，其中黑线姬鼠3份，林姬鼠和鼩鼱各1份（表 2）。 3 讨 论

国内外研究表明，白尾鹿、红鹿等野生动物和家养动物（犬、牛、羊等）均可能是无形体及埃立克体的宿主动物^{[2, 6, 8]}，一些啮齿动物如鼠类可能是其重要动物宿主^{[3, 4, 5]}。本次调查结果表明，集安和宽甸地区野鼠3种蜱媒立克次体的感染率分别为埃立克体 14.39%、无形体6.06%和SFGR 10.61%，埃立克体感染率明显高于无形体（χ²＝8.058，P＝0.018），说明调查地区野鼠存在3种蜱媒立克次体感染，而以埃立克体感染最为严重，与新疆地区沙鼠埃立克体检测阳性率（15.38%）明显高于无形体（5.45%） 的结果一致^[9]。调查中发现宽甸野鼠埃立克体感染明显高于集安（χ²＝3.935，P＝0.047），集安和宽甸同处长白山脉南部地区，鸭绿江畔，有着相似的地理地貌及生境气候，感染率的差异可能是由于捕鼠地生境的小环境不同、鼠种不同所造成。Lin等^[5]应用PCR方法对新疆、浙江、黑龙江等6省（自治区）野鼠4种蜱媒病原体进行调查，无形体和SFGR平均感染率分别为5.50%和9.10%，本次调查结果（6.06%和10.61%）与Lin报道基本一致，但埃立克体检出阳性率（14.39%）明显低于南方林区啮齿动物调查结果（56.40%）^[10]。柴程良等^[11]对浙江省鼠形动物蜱源立克次体感染状况调查发现，无形体感染率（3.80%）明显高于埃立克体（1.07%）和SFGR（0.53%），各地报道的差异可能是由于不同气候和环境条件决定了蜱传播的病原体分布^[12]。研究证明长白山脉南部林区鼠类埃立克体、无形体、SFGR感染较普遍，说明鼠类是这些病原立克次体的重要宿主。由于本研究采用的引物分别为无形体属、埃立克体属特异分型引物和SFGR ompA基因，因此具体种或基因型的鉴别需进一步测序分析。

本次调查野鼠132只，5个鼠种，3种立克次体检出阳性率主要以黑线姬鼠和林姬鼠为主（表 2），该两鼠种是东北地区优势鼠种，也是本次捕获鼠的主要鼠种（84.85%），其他鼠种数量少阳性率低，统计学处理表明不同鼠种对不同病原体感染差异不明显。有报道，长白山林区小啮齿动物粒细胞无形体感染率以褐家鼠和灰仓鼠（Cricetulus migratorius）（55.5%和33.3%）为高^[13]。二者结果的差异可能是由于调查地不同、鼠种分布不同及捕获鼠数量较少所致。

在蜱体内同时存在几种病原体的复合感染国内外已有报道，东北地区全沟硬蜱（Ixodes persulcatus）^[14]、长角血蜱（Haemaphysalis longicornis）^[15]可同时携带多种蜱媒病原体。新疆、浙江、黑龙江等6省（自治区）啮齿动物调查表明，野鼠存在2～3种蜱媒病原体复合感染，复合感染率为2.60%^[5]。本次研究结果证明调查地区鼠类存在埃立克体与无形体或埃立克体与SFGR复合感染，复合感染率为3.79%，提示该地区可能存在三者混合自然疫源地。多种病原的复合感染可通过感染多种病原的蜱一次或多次叮咬而引起^[5]。已知长白山地区不同蜱种携带多种病原体^{[14, 15, 16]}，对该地区从事野外作业的人群增加了多种病原体共同感染的风险，可能导致患者临床症状多样化，给诊断、治疗增加难度^[5]。因此在多种蜱媒传染病流行地区应重视该类疾病的诊断与鉴别，同时应考虑多种病原复合感染的可能。

本次调查证明长白山脉南部的鸭绿江畔林区野鼠3种立克次体感染普遍，表明存在其自然疫源地，为该地区蜱媒立克次体病的疫源地证实和该类疾病的预防、诊治与控制提供了科学依据。提示该地区军民，特别是野外作业人员及外来旅游人员应做好防蜱、防鼠的个人防护，医务人员应掌握蜱媒病的种类与特点，积极做好这类疾病的治疗与防制工作。