小肠结肠炎耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）在世界各地均有发现，而且是危害严重的食源性、人兽 共患性致病菌。由其感染引发的疾病在发达国家、 发展中国家均有非常高的流行性^[1]，已被列入多个国家出入境检疫的常规项目。而且，小肠结肠炎耶尔森菌是幼儿肠炎的主要致病菌之一，以急性腹泻、腹痛和发热为主要症状。

登封市在2013年的小肠结肠炎耶尔森菌监测中，发现1例幼儿腹泻患者，从其粪便标本中检测出小肠结肠炎耶尔森菌。我们利用PCR技术检测小肠结肠炎耶尔森菌的毒力基因发现，该菌株携带致病性毒力基因，为致病性菌株。由于我国近年来小肠结肠炎耶尔森菌感染患者少见，特报道如下。 1 材料与方法 1.1 样本来源

韩某某，女，12月龄，登封市人。于2013年7月1日发病，以每天腹泻次数6次为主诉就诊，大便呈黏液稀便，体温38.5℃。食欲差，精神不 佳，面色可，皮肤弹性可，无脱水征。心肺（-），腹部压痛，无反跳痛，肠鸣音亢进。2013年7月9日在登封市某监测哨点诊所就诊时第1次采集粪便标本送 检。病情稳定1个月后，2013年8月12日第2次采集粪便标本检测。 1.2 方法 1.2.1 菌株的分离培养

采集的标本于4℃冷增菌 培养，分别于7、14、21d后转种耶尔森菌选择性培养基，25℃培养24～36h，挑取疑似菌落转种克氏双糖斜面25℃培养24h，选择克氏双糖+/+、不产气、H2S－，接种于尿素培养基及半固体培养基，选择尿素酶+、25℃培养动力+、37℃培养动力-，镜检为革兰阴性菌或椭圆或球杆菌细菌者，使用API20E（法国生物梅里埃公司API20E肠道菌生化鉴定板条）生化板条进行系统生化鉴定。 1.2.2 菌株的血清分型

对于鉴定为小肠结肠炎耶尔森菌的菌株进行血清学分型，同时设盐水对照。 1.2.3 PCR检测

使用天根细菌DNA抽提试剂盒提取DNA。具体操作按说明书进行。

PCR检测小肠结肠炎耶尔森菌黏附侵袭点基因（ail）、耐热性肠毒素基因（ystA）、生物1A型携带的肠毒素基因（ystB）、黏附素（yadA ）、yop调节子转录活化作用因子（virF）。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离（170 V，30 min）。引物序列详见文献^[2]。 1.3 试剂及仪器设备

耶尔森菌选择性培养基及配套抗生素为美国BD公司产品，0.1mol/L磷酸盐缓冲盐水（pH7.4，改良PBS）、克氏双糖铁琼脂（KIA）、动力吲哚尿素培养基（MIU）均购自上海疾病预防控制中心。小肠结肠炎耶尔森菌分型血清购自日本生研株式会社（包括O∶1，2、O∶3、O∶5、O∶8、O∶9），菌株鉴定用API20E生化板条及配套试剂均系购自法国生物梅里埃公司，PCR扩增相关试剂及引物合成来自上海生工生物工程技术服务有限公司，PCR热循环仪、电泳仪、凝胶成像仪均为美国Bio-Bad公司产品。PCR扩增用Premix、2000bp DNA Ladder（DL2000）购自TaKaRa公司。PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。Goldview 购自北京赛百盛基因技术有限公司。 2 结果

从该幼儿第1次采集的粪便标本中检出小肠结 肠炎耶尔森菌，镜下见革兰染色阴性短杆菌。该菌 氧化酶阴性，触酶阳性，无硫化氢产生，尿素酶试验 阳性，ONPG（邻硝基酚-半乳糖苷酶）试验阳性，25 ℃培养动力阳性，37 ℃培养动力阴性，血清分型 为O∶3，生物型为3型。PCR检测小肠结肠炎耶尔 森菌ail＋、ystA＋、ystB－、yadA＋、virF＋。第2次采集的 粪便标本中未检出小肠结肠炎耶尔森菌。 3 讨论 3.1 生物学分类及危害

目前的研究显示，耶尔森菌属有17个种^[2]，其中致病的有3个种。它们为鼠疫耶尔森菌（Y.pestis）、假结核耶尔森菌（Y.pseudotuberculosis）和小肠结肠炎耶尔森菌。20世纪80年代，小肠结肠炎耶尔森菌是引起社会广泛关 注的一种粪-口途径传播的病原菌。我国于1986 年、1987年先后发生两起小肠结肠炎耶尔森菌感染 而暴发的流行，造成500余人感染^[3]。近些年来，小肠结肠炎耶尔森菌在我国的感染主要以散发为主。 WHO将耶尔森菌（除鼠疫耶尔森菌以外）感染引起的疾病统称为耶尔森菌病。它可以引起发热、腹泻 等肠道症状，还可以引起心血管系统、呼吸系统、骨骼结缔组织等肠道外的感染^[4]，易留下后遗症。尤其要关注的是幼儿及儿童患者。 3.2 病菌携带者

登封市该幼儿患病以来临床表现较重，出现发热（39.5℃）、腹泻、腹痛等症状。患儿家属带其及时就医，并采集粪便样本，接受医疗救 治，控制了病情发展。依据培养、鉴定结果，该幼儿小肠结肠炎耶尔森菌生物型为1A型致病性菌株，血 清型为O∶3型，为致病性菌株。这是自2009年登封市开展小肠结肠炎耶尔森菌监测以来首次在幼儿粪便中检测出致病性阳性菌株。 3.3 分子生物学研究

目前利用PCR技术检测小肠结肠炎耶尔森菌的毒力基因^{[5, 6]}，小肠结肠炎耶尔森菌携带有ail、ystA、ystB、yadA、virF 等基因。历史 研究资料显示^[6]，携带ystB的菌株为非致病性菌株；不携带ystB，而携带ail、ystA、yadA、virF的菌株为致病性菌株。结果显示登封市该幼儿粪便中检出的小肠结肠炎耶尔森菌毒力基因为ail＋、ystA＋、ystB－、yadA＋、virF＋，说明该菌株携带致病性毒力基因，为致病性菌株。具有较强致病性的小肠结肠炎菌株引 起该幼儿严重的临床表现，从微生物学上得到了科学的解释。小肠结肠炎耶尔森菌带毒株首次在登封 市幼儿粪便中的检出，为今后制定预防该病的策略提供了有力的基础资料。