啮齿类动物是哺乳动物中种类最多，分布范围最广的一个类群，全世界有2000多种，除南极洲以外均可以找到它的踪迹^{[1, 2]}。而且啮齿类动物与人类的生存环境往往重叠，如房屋、农田、牲畜圈或城市郊区等^[1]。正由于其分布广泛，密度大，与人接触机会多，啮齿类动物已经成为人类传染病最重要的传染源。至今已发现啮齿类动物能传播60多种传染病，如：鼠疫、拉沙热、肾综合征出血热、钩端螺旋体病、博那病、森林脑炎、地方性斑疹伤寒、莱姆病、恙虫病等，严重危害人类的生命与健康^[1]。本次调查的黑瞎子岛位于中国东北地区，地处中俄边境，生态系统相对隔绝。中俄划界后，黑龙江省正将其开发为旅游区。因此了解该地区小型哺乳动物的物种组成及系统发生关系，对多种自然疫源性疾病的预防和控制具有重要的科学指导意义，为科学开发黑瞎子岛提供依据。

2012年在黑龙江省抚远县黑瞎子岛采用夹夜法捕捉小型哺乳动物。首先对所捕获动物进行形态学鉴定，然后在无菌条件下解剖，取肺组织放入液氮保存。标本送中国疾病预防控制中心传染病预防控制所。

取30 mg肺组织，放在已加入600 μl裂解液RL的2 ml无RNA酶的EP管，使用组织破碎仪破碎肺组织。按照北京康为世纪DNA提取试剂盒的说明书提取DNA。提取到的DNA保存于-20 ℃。

在形态学鉴定的基础上，扩增肺组织线粒体细胞色素b（mt-cyt b）基因，用于分子生物学的鉴定。PCR反应体系包括25μl 2×Mix Taq，18 μl DEPC水，2 μl引物，3 μl模板。所用引物为L14724F和H15915R^[3]。反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，扩增35个循环；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检查结果。条带单一并且符合预期大小的产物送北京擎科新业生物技术有限公司测序。

测序结果用Chromas Version 1.62软件进行相关峰图的检查，确保序列的准确性；用DNAStar（version 5.01）软件中的EditSeq对序列进行编辑，MegAlign进行核苷酸和氨基酸序列的同源性比较；从GenBank中下载mt-cyt b基因的参考序列；用PhyML 3.1软件构建系统发生树^[4]。

2012年在黑龙江省抚远县的黑瞎子岛共捕获374只小型哺乳动物，形态学鉴定结果包括2目4科6属9种（表 1），分别是啮齿目的黑线姬鼠（Apodemus agrarius）、红背鼠平（Myodes rutilus）、莫氏田鼠（Microtus maximowiczii）、东方田鼠（M. fortis）、大林姬鼠（Ap. peninsulae）、褐家鼠（Rattus norvegicus）和花鼠（Tamias sibiricus），以及食虫目的阿尔泰鼩鼱（Sorex roboratus）与中鼩鼱（S. caecutiens）。其中啮齿动物占捕获总数的98.93%，红背鼠平和黑线姬鼠分别占38.50%和36.63%，为优势种。

表 1 黑瞎子岛地区鼠形哺乳动物的种类及构成比 Table 1 The species diversity of small mammals in the Bolshoy Ussuriysky Island,Heilongjiang province,China

表选项

琼脂糖凝胶电泳显示，对啮齿目与食虫目所有生物种的扩增结果条带单一，约为1200 bp，符合预期大小（图 1）。

图 1 PCR扩增mt-cyt b基因的电泳结果 Figure 1 PCR amplification of mt-cyt b gene

图选项

本研究中的鼠亚科哺乳动物包括黑线姬鼠、大林姬鼠、褐家鼠。其中黑线姬鼠的mt-cyt b基因相互之间的核苷酸同源性为98.4%～99.3%，与地理上相对近的俄罗斯哈巴罗夫斯克地区、俄罗斯滨海边疆区和韩国的黑线姬鼠序列同源性分别为98.8%～99.8%、98.7%～99.3%和99.0%～99.4%，系统发生分析也表明在东亚地区这些黑线姬鼠之间的亲缘关系较近，在进化树上聚在一起，均为东北亚种。值得注意的是，黑瞎子岛上的黑线姬鼠并未完全聚集在一起，表明黑线姬鼠在东亚地区的迁徙。另外，黑瞎子岛上的东北亚种，与中国的长江亚种、华北亚种和台湾亚种代表序列的同源性分别为98.5%～98.7%、98.3%～98.7%和97.6%～97.8%，并且在系统发生树上形成了不同的分支（图 2）。

图 2 鼠科mt-cyt b基因的系统发生树 Figure 2 Phylogenetic analysis of mt-cyt b gene of Muridae

图选项

黑瞎子岛上大林姬鼠的mt-cyt b基因相互之间的核苷酸同源性为99.4%～99.5%，与地理上邻近的吉林省长春、俄罗斯哈巴罗夫斯克地区的大林姬鼠的序列同源性分别为99.4%～99.6%，系统发生分析也表明这些序列的亲缘关系较近，进化树上聚集在一个分支，属于东北亚种（图 2）。而与朝鲜半岛、中国青海亚种以及华北亚种的代表序列同源性却相对较低，分别为98.1%～98.5%、98.1%～98.4%和98.2%～98.7%，在系统发生树上形成了不同的分支（图 2）。

黑瞎子岛上褐家鼠的mt-cyt b基因相互之间的核苷酸同源性为99.9%，并且与地理上邻近的黑龙江省哈尔滨、内蒙古牙克石、俄罗斯哈巴罗夫斯克的序列同源性为99.5%～99.8%，系统发生树上聚在一个小的分支，属于东北亚种；而与地理上相对远的中国华北亚种、甘肃亚种以及指名亚种的代表序列同源性也很高，分别为99.6%、99.5%～99.6%和99.5%～99.6%，在系统发生树上和东北亚种聚在一起，表明它们的亲缘关系较近（图 2）。但与浙江省永嘉地区获得序列的同源性却很低，为94.3%～94.4%，在系统发生树上形成了不同的分支（图 2）。

本研究在黑瞎子岛上捕获的仓鼠科哺乳动物包括红背鼠平、东方田鼠和莫氏田鼠。其中红背鼠平的mt-cyt b基因相互之间核苷酸同源性为98.3%～99.5%，并且与中国吉林省、俄罗斯东部的哈巴罗夫斯克和马加丹的代表序列同源性为98.0%～99.6%，系统发生分析表明这些序列的亲缘关系较近，在进化树上聚在一起。另外，黑瞎子岛上的红背鼠平序列与地理上相对远的日本北海道、美国阿拉斯加以及芬兰索特卡莫的序列同源性相对较低，分别为96.4%～97.4%、96.3%～97.1%和96.8%～97.5%，在系统发生树上形成了不同的分支（图 3）。

图 3 仓鼠科mt-cyt b基因的系统发生树 Figure 3 Phylogenetic analysis of mt-cyt b gene of Circetidae

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黑瞎子岛上东方田鼠的mt-cyt b基因相互之间的同源性为100%，与来自地理上相对近的中国东北地区的吉林省和黑龙江省的乌苏里亚种、俄罗斯赤塔州、蒙古色楞格省的东方田鼠代表序列同源性为99.1%～100%，系统发生分析表明这些序列的亲缘关系较近，在进化树上聚在一起，均为同一东北亚种。另外黑瞎子岛上的东北亚种与中国南部地区的江苏亚种和福建亚种的代表序列同源性相对较低，分别为98.3%和98.5%，在系统发生树上形成了不同的分支（图 3）。

黑瞎子岛上莫氏田鼠的mt-cyt b基因相互之间的同源性为99.7%，与内蒙古牙克石和俄罗斯赤塔州的序列同源性为98.2%～99.0%，系统发生分析表明它们的亲缘关系较近，在进化树上聚在一个分支，然而和蒙古国中央省的序列同源性只有96.8%，在系统发生树上独自形成一个分支（图 3）。

本研究中松鼠科哺乳动物只有花鼠。花鼠的mt-cyt b基因相互之间的核苷酸同源性为98.6%～99.6%，与地理上相对近的俄罗斯的哈巴罗夫斯克、赤塔州、马加丹、雅库茨克地区，中国的黑龙江以及日本北海道的花鼠序列同源性为98.2%～100%，系统发生分析也表明在东亚地区这些花鼠之间的亲缘关系较近，在进化树上聚在一起。但与同样为远东国家的韩国序列同源性相对较低，为89.4%～90.3%，在系统发生树上位于另外一个分支（图 4）。

图 4 花鼠mt-cyt b基因的系统发生树 Figure 4 Phylogenetic analysis of mt-cyt b gene

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本研究中的食虫目包括阿尔泰鼩鼱和中鼩鼱。其中阿尔泰鼩鼱的mt-cyt b基因相互之间的核苷酸同源性为100%，与地理上很近的俄罗斯马加丹以及哈巴罗夫斯克地区两个阿尔泰鼩鼱亚种的核苷酸同源性分别为 99.1%和98.8%，在系统发生树上形成一个独立的分支，同时又分为2个小分支，分别为中国和俄罗斯的序列（图 5）。

图 5 食虫目mt-cyt b基因的系统发生树 Figure 5 Phylogenetic analysis of mt-cyt b gene of shrew

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黑瞎子岛上中鼩鼱的序列与俄罗斯的新西伯利亚和科什阿加奇区以及韩国Mt Odae地区的中鼩鼱序列同源性为99.6%～99.7%，与地理上相对远的芬兰拉普兰的序列同源性为99.5%，系统发生分析表明黑瞎子岛、俄罗斯、韩国、芬兰的序列亲缘关系较近，在进化树上聚在一起。有趣的是黑瞎子岛的中鼩鼱序列和地理上相对近的日本北海道的中鼩鼱序列同源性只有93.9%，在系统发生树上独立形成一支（图 5）。

哺乳动物的形态学鉴定主要依据头骨、牙齿和毛发颜色等解剖形态学特征来判断，需要专业的知识背景和丰富的现场实践工作经验，而且对于亲缘关系比较近的物种，往往不能准确鉴定。而采用分子生物学的方法可以快速准确地鉴定物种，精确地获得物种的遗传信息，并且可以对幼体和捕捉过程中造成的不完整个体进行准确鉴定^[5]。所以建立一个系统完整的哺乳动物鉴定平台能够使疾病控制人员准确鉴定宿主物种，有利于对突发疫情的预防和控制。本研究采用形态学和分子生物学相结合的方法对黑瞎子岛地区小型哺乳动物物种进行鉴定，不仅可以知道该地区小型哺乳动物的物种构成，还可以准确得到mt-cyt b基因的遗传信息，用于同源性比较和系统发生分析。

通过mt-cyt b基因的同源性比较和系统发生分析可知，岛上小型哺乳动物的mt-cyt b基因未发生明显变异。而且有文献报道通过mt-cyt b基因构建系统发生树可以反映物种的地理分布、迁徙路线^{[6, 7]}。所以从系统发生树可以知道阿尔泰鼩鼱、大林姬鼠、东方田鼠、莫氏田鼠表现出一定程度的地理聚集现象，但中鼩鼱、黑线姬鼠、褐家鼠、红背鼠平、花鼠没有明显的地理聚集现象，反映出这些物种在更广泛地区的迁徙，从而导致相关病原体的播散^[8]。由于现有数据不全，分析结果可能会有一些不准确，随着序列的不断补充，可能对上述物种的迁徙路线有更清楚的认识。因为国内对鼩鼱科的mt-cyt b基因研究还处于空白阶段，国际上阿尔泰鼩鼱只有2个俄罗斯的亚种为全序列，对中鼩鼱的研究也不多，所以本研究中对阿尔泰鼩鼱和中鼩鼱mt-cyt b基因的扩增补充了这方面的空缺。

黑瞎子岛位于黑龙江省抚远县境内，是我国东北部的极角，东与俄罗斯哈巴罗夫斯克市接壤。不论是大范围的东北地区，还是小范围的东北边境地区，均有关于啮齿动物携带自然疫源性疾病病原体的报道^{[9, 10]}，其中包括病毒、细菌、立克次体和寄生虫。典型的自然疫源性疾病如汉坦病毒引起的肾综合征出血热，该病流行广，病情危急，病死率高，危害极大，黑龙江地区是我国最早发现该病的地区，病原宿主主要是啮齿动物^{[11, 12]}，而且在黑瞎子岛地区的黑线姬鼠、莫氏田鼠、阿尔泰鼩鼱中均检测到该病毒^[13]。细菌性疾病主要为钩端螺旋体（钩体）引起的钩体病，人通过接触被啮齿动物尿液污染的水源、土壤或食物而感染，死亡率较高，而本研究中的优势鼠种黑线姬鼠和红背鼠平正是黑龙江地区钩体的主要宿主^[14]。立克次体引起斑疹伤寒及恙虫病等疾病，该病原在寄生虫和哺乳动物之间维持着长久持续的循环，人一旦接触就有可能感染或发病，从黑线姬鼠和红背鼠平中均曾分离到立克次体^[15]。中俄边境地区的优势鼠种为黑线姬鼠与数量相对少的东方田鼠、褐家鼠和大林姬鼠均是很多寄生虫的宿主，如蜱、螨、蚤^[16]。它们是很多病原体的传播媒介^[16]。比如，蜱媒传染病病原体有斑点热立克次体、贝克柯氏体、查菲埃立克体、伯氏疏螺旋体及森林脑炎病毒^[17]；螨可引起过敏性哮喘、变应性鼻炎、荨麻疹、过敏性皮炎等，严重危害人类健康^[18]；虽然现代社会蚤传播的鼠疫已经很少见，但也是不可忽视的一个严重传染病^[19]。从以上情况可以推测，黑瞎子岛地区的小型哺乳动物可能携带或传播多种自然疫源性疾病的病原体。随着该地区旅游业的发展，人员往来越来越频繁，从而增加了各种传染病传播的风险。

本研究使用形态学和分子生物学相结合的方法对黑瞎子岛地区小型哺乳动物的种群构成，各亚种之间的同源性和系统发生进行研究，探讨了可能由其引发的自然疫源性疾病，可对该地区多种自然疫源性疾病的预防和控制产生重要的指导性意义，为科学开发黑瞎子岛提供依据。