澳洲麻蝇〔Sarcophaga australis （Johnston et Tiegs，1921）〕隶属双翅目（Diptera）麻蝇科（Sarcophagidae）麻蝇属（Sarcophaga）澳麻蝇亚属（Australopierretia），主要分布于澳大利亚首都堪培拉、新南威尔士北部地区、昆士兰、维多利亚州以及澳大利亚南部和西部，最早是在1921年被Johnston 和 Tiegs^[1]在腐肉中发现。

传统的生物分类主要依据生物的形态学特征。麻蝇的种类鉴定主要依靠雄性外生殖器特征，雌性麻蝇的分类一直非常困难，很难对其进行准确的种类鉴定，就连很有经验的分类学家也难以区分雌性麻蝇^[2]。尽管有研究发现雌性麻蝇的子宫骨片有明显的种间区别^[3]，可以利用雌性麻蝇的子宫骨片来鉴定种类^{[4, 5]}，但由于材料与资料的缺乏，该方法还未被广泛应用于种类鉴定中。在全球经济一体化快速发展的今天，频繁的国际贸易以及国际间快捷便利的交通运输，给像澳洲麻蝇这样的外来医学媒介生物的入侵提供了便利。在口岸的日常检疫过程中经常会截获这样的外来物种，必须快速准确地鉴定其种类，以有效阻止外来物种的入侵^[6]。

DNA条形码技术的出现弥补了形态学鉴定的不足，它是一种应用生物本身所具有的有足够变异的标准化短基因片段对物种进行快速、准确鉴定的生物身份识别技术^[7]。将DNA条形码技术与传统形态特征相结合的方法（又称“条形码与形态分类法” 、“Barcoding and Morphology”，简称B & M），对物种的鉴定更有效、更准确^[8]。DNA条形码的不断发展，在物种分类和鉴定方面展示出强大的生命力，而且在生物学各相关领域中得到广泛应用，在口岸检验检疫的应用也越来越普遍^[9]。本研究应用条形码与形态分类法，对截获的雌性蝇类进行快速、准确鉴定，确认其为澳洲麻蝇，经过科技查新发现是中国未见分布种，属国内首次截获。

2014年4月30日中山出入境检验检疫局神湾办事处从澳大利亚入境装载有鲜葡萄的货船上截获1只蝇类，送往卫生检疫实验室做成针插标本，然后拍照存档（图 1）。标本保存在中山出入境检验检疫局卫生检疫实验室标本室内。

图 1 截获的蝇种 Figure 1 External form of the intercepted fly

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根据《中国常见蝇类检索表》^[5] 和国外的参考文献^[1]在解剖镜下对截获蝇类进行形态学鉴定，并描述其形态特征。

取蝇的1条后足用于基因组DNA的提取，按TIANGEN公司生产的TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒的使用手册进行基因组DNA提取。

PCR扩增所用引物为通用引物：LCO1490 5′-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3′，HCO2198 5′-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3′^[10]，由宝生物工程（大连）有限公司合成，EX-Taq DNA聚合酶、dNTP等PCR试剂从宝生物工程（大连）有限公司购置。

EX-Taq DNA聚合酶扩增条件：94 ℃变性5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，反应30个循环；72 ℃延伸10 min。

PCR反应体系（50 μl）：10倍PCR缓冲液5 μl；正向引物（20 μmol/L）2 μl； 反向引物（20 μmol/L）2 μl；dNTP（10 mmol/L）2 μl；Ex-Taq（5 U/μl）1 μl；模板DNA 3 μl（50 ng/μl）；无菌水35 μl。

采用TIANGEN公司生产的pGM-T Ligation Kit试剂盒，按照试剂盒使用手册对截获蝇类的纯化PCR产物进行克隆。

分别随机挑选3个阳性的转化子送交Life Technologies（广州市）测序。将所截获蝇类的序列上传至NCBI，基因序列号见表 1，在GenBank及BOLD中进行比对，序列比对不包括引物部分。

根据《中国常见蝇类检索表》判定截获蝇类为雌性麻蝇科种类，无法鉴定到种。

DNA测序结果经Mega 6.0软件^[11]验证图谱为有效序列，去掉两端的引物得到全长有效序列为658 bp。序列在NCBI和BOLD中进行比对，Blast结果表明，克隆后测出截获蝇类的序列与GenBank中公布的澳洲麻蝇（登录号：JN964740）细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）基因序列相似性为100%，在BOLD中的比对结果也为100%的澳洲麻蝇（图 2）。

图 2 截获蝇类的DNA条形码序列在BOLD中的比对结果 Figure 2 Results of the DNA barcoding sequences matched in the BOLD

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选取GenBank 中与目的片段核苷酸序列比较所得相似性最高的7个物种序列，分别是澳洲麻蝇、黄须亚麻蝇〔Sarcophaga （Parasarcophaga） misera〕、褐须亚麻蝇〔Sarcophaga （Parasarcophaga） sericea〕、波突酱麻蝇〔Sarcophaga（Liosarcophaga） jaroschevskyi〕、酱麻蝇〔Sarcophaga （Liosarcophaga） dux〕、绯角隶麻蝇〔Sarcophaga （Liopygia） ruficornis〕、肥须隶麻蝇〔Sarcophaga （Liopygia） arassipalpis〕、金翅鬃麻蝇〔Sarcophaga （Sarcorohdendorfia） seniorwhitei〕、羚足鬃麻蝇〔Sarcophaga（Sarcorohdendorfia） antilope〕（表 1），用Mega 6.0软件构建NJ树。

表 1 截获蝇类及GenBank中相似性高的种类比较信息表 Table 1 Comparison of the sample to its similar species in GenBank

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结果如图 3所示，NJ树上所标数字为置信度。本研究所获得蝇类的序列以及GenBank中的澳洲麻蝇（JN964740）聚为一类，置信度高达100%，与酱麻蝇亚属、亚麻蝇亚属、隶麻蝇亚属、鬃麻蝇亚属、澳麻蝇亚属共同聚成麻蝇属。因此可以根据DNA条形码判断此次所截获的雌性麻蝇为澳洲麻蝇。

图 3 基于DNA条形码序列构建的NJ树（Kimura 2-parameter模式） Figure 3 Neighbor-joining tree based on DNA barcodes of the 658 bp (Kimura 2-parameter model)

图选项

为便于今后使用形态特征对澳洲麻蝇进行形态鉴定，根据国外参考书和参考文献^[1]将澳洲麻蝇的形态特征归纳如下。

小型麻蝇，体形细长，体灰色，体长约5 mm，体宽1～2 mm。

雄性：前额相对突出，最窄处的宽度大约为复眼宽的一半。复眼红褐色。侧额、颊和后头在光线下呈银白色。间额深褐色，比侧额稍宽；间额鬃8。内顶鬃大，外顶鬃和后顶鬃缺；眼后鬃2行，第1行较完整；后头有银色的毛，下侧毛变得长而稀；侧颜淡黄褐色，下端近口缘处有细黑毛；颊有黑色鬃毛。触角第1节接缝不明显；第2节大、深褐色且有银色的花纹；第3节灰黑色，有银色粉被，长度小于第2节的2倍，触角芒羽状，端部裸。喙黑褐色，内侧部分较白；下颚须黑色；髭毛接近口缘部。胸与头等宽，银灰色，有3条延伸到盾片的黑色纵条，但旁边2条颜色较弱；胸部侧面和腹面深灰色，前气门小，上有棕色细毛。前中鬃弱，呈细毛状，后中鬃1，强壮；背中鬃2＋3，后2对后中鬃特别粗大，最前1对比后中鬃要强大；有小盾端鬃；翅内鬃1＋2；肩鬃3；肩后鬃2，前1对较粗大。翅的前缘脉多毛；r1和r4＋5脉背面具硬毛，径脉结节腹面有毛。腿黑，前足股节无毛，胫节比跗节短，具2后背鬃；中足和后足无毛，中足股节无密毛，具4前鬃，胫节比跗节短，前背鬃1，后背鬃3；后足基节后侧有细毛，股节有3前腹鬃和3后腹鬃，胫节和跗节等长，具2前腹鬃，5前背鬃和2后背鬃。腹部灰黑色，具粉被，与胸部等长，卵圆形；背板上覆有短刚毛；腹板有细小纤毛；后腹有长的鬃毛。第7、8合腹节淡灰色；第9腹节亮灰色，有毛，背面有浅棕色镶嵌其中；肛尾叶相对较大，亮黑色，尖锐，非常多毛；侧尾叶半圆形，有毛。阳茎骨化强，膜状部突起；侧阳体半圆形，有1对很长的端部侧突，几乎与肛尾叶平行。

雌性：额宽为头宽的1/3。第2腹板有2对缘鬃，第1、2合背板和第3背板各具1对侧鬃，第4背板和第5背板各具4对缘鬃。其余与雄性相似。

在检验检疫过程中截获的外来病媒昆虫，特别是雌性的病媒昆虫，由于缺乏形态学资料而无法鉴定，给检验检疫工作带来严重影响。传统的形态学分类主要依靠雄性外生殖器的特征，雌性的鉴定一直是一个技术难题，DNA条形码技术的应用弥补了这一缺陷。研究结果表明，在长度为658个碱基的片段与GenBank所鉴别的种类中，与同种的序列一致性高达100%，与其他近似种的一致性＜91%，因此可以进行蝇种的准确鉴别。本研究对截获的蝇类从形态学鉴定为雌性麻蝇科种类，DNA条形码检测的结果其为澳洲麻蝇，通过查阅国外有关澳洲麻蝇形态描述的文献确定该种为澳洲麻蝇。传统形态学鉴定与DNA条形码结合的方法相互验证，可以更准确地对外来物种进行鉴定，将条形码与形态分类法应用在检验检疫工作中，可以实现对外来雌性麻蝇的快速准确鉴定。

经过科技查新发现中国无关于澳洲麻蝇的任何研究报道，是我国口岸首次截获。如果澳洲麻蝇在我国存活繁衍，存在与同一生态位蝇种竞争的可能，很有可能对生态系统带来一系列危害。因为其腐生或粪生的生活习性，也有可能会携带大量的细菌和病原体，存在传播病菌的风险。由于麻蝇可以传染肠道性疾病和引起人畜患蝇蛆病，因此被看作检疫性害虫而受到长期监测和控制^[12]。

随着经济全球化迅速发展，我国对外贸易越来越频繁，口岸截获的外来医学媒介生物种类和数量也在不断增长，外来物种入侵的概率也越来越高。及时对外来入侵物种进行快速、准确的种类鉴定，可以有效防止外来物种入侵对我国生态环境造成危害，保护口岸卫生安全和人类健康。随着DNA条形码技术的不断发展，利用条形码与形态分类法将能更快速、准确地鉴定外来入侵物种，为检验检疫提供有力的支持。