疟疾是经蚊媒传播的重要热带病，主要流行于热带和亚热带地区^[1]。辽宁省地处中纬度地区，因所处地理位置、气候等多种因素影响，2008－2013年全省报告的疟疾病例均为散发，无暴发流行等疫情，年发病率均在1/10万以下，且自2012年至今，未发现本地感染病例。尤其是2010 年起实施《中国消除疟疾行动计划（2010－2020年）》，辽宁省疟疾疫情已得到有效控制。在该背景下，对于疟疾病例的诊断水平提出了更高要求。本研究选取辽宁省2011－2013年102例疟疾疑似病例的血涂片及抗凝全血进行病原形态学显微镜检查、免疫层析技术（OptiMAL法）和分子生物学巢式PCR检测，并进行比较分析。

来源于辽宁省2011－2013年疟疾疑似病例。

rTaq　聚合酶、DL2000 Marker、琼脂糖购自宝生物工程（大连）有限公司； DNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司；OptiMAL疟疾胶体金试剂条购自BioMed。主要仪器包括显微镜（OLYMPUS，CX31）、PCR基因扩增仪（BioRad，IQ5）、凝胶成像系统（UPS，Alphalmager IS-2200）。引物序列由INVITROGEN公司合成。

按照WHO及行业标准WS 259－2006《疟疾诊断标准》附录C《病原学检查》规范要求，进行厚薄血膜制作与吉氏染色，显微镜油镜下检查。

检测时，滴加5 μl全血样本于试剂卡加样孔处，随后垂直缓慢滴加2滴缓冲液，15 min内读取结果。

采用Qiagen公司的DNA提取试剂盒提取核酸后，-20 ℃保存。对疟疾患者全血的核酸进行PCR扩增，引物序列见表 1。第一轮PCR：反应程序 94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，步骤2～4循环34次后，72 ℃ 5 min。第二轮PCR：10×PCR buffer 5 μl，dNTP 4 μl，引物各1 μl，rTaq 聚合酶 0.5 μl，模板1.5 μl，ddH2O 37 μl。反应程序同上。扩增产物经电泳后于凝胶成像系统中观察结果。

表 1 巢式 PCR检测疟原虫种类的引物及其扩增产物长度

表选项

采用SPSS 13.0软件进行数据分析，计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

102例疟疾疑似患者中，镜检法阳性数56例，阳性率为54.90%；抗原检测阳性65例，阳性率为63.73%；巢式PCR检测阳性72例，阳性率为70.59%。本研究结果显示，3种检测方法中，镜检法阳性率最低，OptiMAL阳性率居中，巢式PCR阳性率最高。应用SPSS软件进行统计学分析，将3种检测方法的研究结果两两比较，仅病原学镜检观察与巢式PCR检测法两者比较，差异有统计学意义（χ2＝4.718，P＝0.030），其他方法之间差异均无统计学意义（χ2＝1.300，P＝0.254；χ2＝0.800，P＝0.371）。

在上述疟疾阳性患者中，经实验室检测结合临床特征确诊恶性疟47例，间日疟9例，卵形疟3例，混合感染（均为间日疟与恶性疟混合感染）10例。

综合3种实验检测结果结合临床特征，确诊69例疟疾病例，以此为标准，针对3种检测方法的多种性能进行比较分析，结果见表 2。

表 2 3 种检测方法实验室检测结果

表选项

以形态学检测为主要内容的血涂片显微镜检查，是一种传统的检测技术，迄今仍是疟疾诊断的金标准，且还是多数基层医疗单位主要或唯一的诊断手段，其敏感度可达到血样10～20个原虫/μl^[2]。方法简便、经济，适用于基层应用；缺点是结果判断受检验人员镜检技术、制片染色技术、显微镜质量和视力疲劳程度等因素影响，对于低原虫血症或混合感染病例容易漏诊或误诊，且费时、费力，效率较低^[3]。一旦药物治疗后，疟原虫迅速被裂解、破坏、分解，其形态很快遭到破坏，给原虫染色镜检增加很大难度；而以分子形式存在血液中的乳酸脱氢酶和核酸不受破坏，仍可被检出。这或许是镜检方法检出率偏低的原因之一。

本次实验所选用的OptiMAL试剂盒是以疟原虫乳酸脱氢酶（Plasmodium lactate dehydrogenase，pLDH）为诊断抗原。pLDH有其独特的理化和免疫化学特性，是糖酵解途径的末端酶，在疟原虫的整个红内期均表达。特别值得一提的是，pLDH仅由活的疟原虫产生，故OptiMAL法可鉴别患者体内虫体的死活，由此可检测治疗效果及复染情况^[4]，可作为镜检的有益补充。但是由于OptiMAL试剂盒只是利用pLDH单抗，因而只能检测恶性疟原虫和非恶性疟原虫的感染，还不能具体诊断间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫，且不能诊断混合感染。因此，在疟疾的实验室诊断上存在一定的局限性。

PCR检测是通过体外扩增，使得特异性靶DNA序列拷贝数在数小时内成百万倍的增加，大大提高了检测的敏感性。检测间日疟和恶性疟的敏感度血样分别为0.1个原虫/μl^[5]和1.5个原虫/μl^[6]，高于其他检查方法。研究显示，PCR检测疟疾，不仅假阳性和假阴性极少，而且具有疟原虫种、株的鉴别能力，并能方便地检测出镜检漏诊的混合感染^[7]。近年来，许多学者用PCR技术检测疟原虫的实验室研究和现场应用的报道中，均显示了PCR在疟疾诊断中比镜检和抗原检测方法更具敏感性及特异性^{[8, 9, 10]}。但是PCR方法由于设备、成本等因素，不可能在现场大规模应用。

传统的镜检方法廉价可靠，至今仍是疟疾诊断的金标准，而对于辽宁省这种低流行地区，原虫密度低，受检验人员镜检技术等影响，对于低原虫血症或混合感染者极易漏诊或误诊。OptiMAL法操作简单，对仪器设备无要求；分子生物学诊断技术敏感性高，特异性强，操作相对简单，在各个市级疾病控制机构已广泛掌握。因此，在辽宁省镜检法结合OptiMAL法和PCR法将会大大提高疟疾患者的诊断率。