登革热病毒（Denguevirus，DENV）由伊蚊传播，引起登革热和登革出血热，在全球的热带和亚热带地区广泛流行^{[1, 2]}。DENV有4个血清型，分别为DEN1、DEN2、DEN3和DEN4，这4个血清型因地理聚集现象又各自分为若干基因型别^[3]。DEN2可分为6个基因型，分别为亚洲-Ⅰ型（AsianⅠ，AS-Ⅰ）、亚洲-Ⅱ型（AsianⅡ，AS-Ⅱ）、美洲/亚洲型（American/Asian，AM/AS）、全球型（Cosmopolitan，COS）及美洲型（American，AM），此外，还有一个仅流行于非洲和东南亚地区森林的基因型Sylvatic型^[4]。

秦皇岛市是河北省重要的港口城市，每年人员境外旅游和贸易活动往来频繁。秦皇岛出入境检验检疫局在多艘来自国外登革热疫区的入境船舶上捕获大量输入性蚊类，但此前当地从未见输入性登革热病例的报告^[5]。2012年12月31日报告了1例疑似输入性登革热病例。为了解该病例的病因及病原体，对患者的样本进行血清学分析、病原体基因的获取及病原体分子溯源研究。

患者男性，46岁，曾有出境史，自述在印度金奈市曾有蚊虫叮咬史。主要临床表现为发热、头痛、眼眶痛、腰痛、腹痛、牙龈出血、颜面潮红等症状。血常规检测白细胞为3.8×109/L，血小板为3.1×109/L，尿蛋白+++。2012年12月31日采集患者血清1份，尿液1份，编号为QHD-01-BS1、QHD-01-US。2013年1月4日采集患者第2份血清，编号为QHD-01-BS2。将上述标本按照相应致病性病原微生物包装要求包装，并运送至中国检验检疫科学研究院卫检所实验室。

利用Panbio公司Dengue IgM Capture ELISA试剂盒对样本QHD-01-BS1、QHD-01-BS2中DENV的抗体进行检测。

利用Qiagen公司的Viral RNA Mini Kit提取样本QHD-01-BS1、QHD-01-BS2及QHD-01-US的RNA。随后对提取的RNA进行DENV、基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV）的实时荧光RT-PCR检测。

参照全国登革热监测方案中的引物（DEN-F/R），利用Qiagen公司的 one Step RT-PCR Kit，分别对QHD-01-BS1、QHD-01-BS2和QHD-01-US进行RT-PCR扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并用Qiagen公司的凝胶回收试剂盒进行纯化，纯化产物送上海英潍捷基生物有限公司进行测序。

Lasergene V7.1软件包及Clustal X1.8软件进行基因序列比对及核苷酸的同源性分析，Mega 3.0软件进行基因的遗传距离分析，jModeltest 2.1.4软件计算最佳的核苷酸替代模型，phyML3.1软件中最大似然法构建系统发生树。用于比较分析的DENV序列均来自于GenBank。

DENV IgM检测结果QHD-01-BS1的Panbio units为41.0，QHD-01-BS2的Panbio units为40.9（阴性和阳性对照的PANBIO UNITS分别为2.82、22.49），提示该患者感染DENV。

结果显示，3份样本RNaseP的实时荧光RT?PCR反应均为阳性，说明3份样本的RNA提取成功。同时发现这3份样本的CHIKV实时荧光RT-PCR检测为阴性，QHD-01-BS2的DENV实时荧光RT-PCR检测为阴性，而QHD-01-BS1和QHD-01-US的DENV实时荧光RT-PCR检测为阳性。

利用DEN-F/R引物扩增样本QHD-01-US、QHD-01-BS1及QHD-01-BS2的NS1基因，图 1表明QHD-01-US和QHD-01-BS1扩增出539 bp的目的基因，与预期大小一致，而QHD-01-BS2无条带出现。

图 1 样本 QHD-01-BS1、US中登革热病毒NS1 基因的扩增图谱 Figure 1 Results of RT-PCR for NS1 of QHD-01-BS1，US

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QHD-01-BS1、QHD-01-US的基因序列与DEN2各基因型别的序列进行同源性分析（表 1）。在DEN2的6个基因型中，QHD-01-BS1、QHD-01-US与COM型的同源性较高，为96.0%，同时发现与COM型中的印度株GWL39 INDI-01、 GWL18 INDI-01同源性最高，为97.3%，与中国株FJ11为96.5%；与 Sylvatic型、AM型的同源性最低，均＜90.0%。与AS-Ⅰ、AS-Ⅱ和AM/AS的同源性依次为90.2%、92.5%和90.3%。

表 1 QHD-01-BS1（US）和 DEN2各基因型别的同源性及遗传距离 Table 1 Partial NS1 segment nucleotide identities and genetic distance of QHD-01-BS1(US) with those of other DEN2

表选项

注：上三角为同源性，下三角为遗传距离。同源性为各型中不同代表株的均值；遗传距离为各型中不同代表株的均值。

QHD-01-BS1、QHD-01-US与DEN2中6个基因型的基因距离分析，从表 1中可以看出QHD-01-BS1、QHD-01-US与COM的种内变异较小，遗传距离为0.04，同时发现与COM型中的印度株GWL39 INDI-01、GWL18 INDI-01的种内变异最小，其遗传距离为0.03，与中国株FJ11的遗传距离和COM型种间距离一致；在5个流行基因型中与AM型的种间变异较大，其遗传距离为0.12；与AS-Ⅰ、AM/AS种间变异相同，其遗传距离为0.11。

根据QHD-01-BS1、QHD-01-US和DEN2的各型NS1基因序列，选择最佳的核苷酸替代模型（TrN＋I）构建系统进化树。从图 2可以看出，5个常见的基因型别各自聚集在一起，自展值均高于50，提示构建的进化树比较可靠。从亲缘关系来看，QHD-01-BS1、QHD-01-US与Sylvatic型的Dak Ar 578、Dak Ar D75505株的亲缘关系最远，与AS-Ⅰ型中的泰国1979年、1984年及2001年的病毒分离株、AS-Ⅱ的印度尼西亚株1022DN、秘鲁株IQT2913、哥伦比亚株1348600、新几内亚岛株New Guinea C、AM/AS型BID-V系列病毒分离株及AM型汤加株Tonga74亲缘关系较远，处在不同进化支。QHD-01-BS1、QHD-01-US与印度2001年分离的病毒株GWL39 INDI-01、GWL18 INDI-01的亲缘关系最近，在系统进化上聚集在一起，并与中国1999年分离的FJ11株在COM型的进化支上。

图 2 基于 DEN2的 NS1 基因构建的进化树 Figure 2 Phylogenetic trees based on the partial NS1 segment of DEN2

图选项

随着气候生态条件的变化，DENV感染呈扩大趋势，已经成为热带及亚热带地区严重的公共卫生问题。近年来，输入性登革热疫情在边境口岸不断增多。黄勇等^[6]通过核酸及血清学检测确诊了东莞市首例输入性登革热病例；王宇平等^[7]借助PCR技术在福建口岸截获首例输入性登革热病例并确定登革热毒株来源于太平洋群岛地区；孔东锋等^[8]用血清学检测方法确诊了首例深圳市输入性登革热病例。综上所述，血清学方法结合PCR技术利于对输入性病例的确诊和追踪溯源。本研究中根据患者的蚊虫叮咬史，利用上述方法准确地确定了该患者感染的DENV基因型别及感染来源，为秦皇岛口岸首例输入性登革热病例确认提供了科学方法和技术。

对于DENV基因的获取主要从患者的血清中进行扩增，很少有报道从患者的尿液中直接扩增。但近年来日本学者Takanori Hirayama建立了针对尿液中DENV核酸检测的实时荧光PCR，研究发现患者感染DENV 0～7 d，血清检出率＞50%，而感染6～16 d时尿液的检出率＞50%^[9]。提示在今后的检测中不确定患者的感染天数时，应将血清和尿液样本同时检测可以提高病毒的检出率。本研究中从QHD-01-US扩增出NS1基因，可能印证了上述观点。同时，QHD-01-BS2中DENV IgM检测结果为阳性而核酸检测为阴性，提示当血清中IgM抗体出现时，血清中的病毒会被清除导致病毒载量降低，同时也表明临床血清登革热病例中核酸出现阳性的窗口期较短，临床诊断中血清核酸检测结果必须综合考虑采样时间和临床病程^[10]。

DENV的分型常以E基因为基础进行基因型别划定，也有以240 bp E/NS1基因为基础构建的进化树^{[11, 12, 13]}。前者构建的进化树能将DEN2的6个基因型别区分开来，而且构建的进化树比较可靠，而后者构建的进化树不能完全区分DEN2的型别，且自展值比较低^{[14, 15]}。本研究尝试用539 bp的NS1基因序列构建进化树，与之前构建进化树不同的是，先评价并计算出建树的最佳核苷酸替代模型，构建的进化树与以E基因构建的进化树一致。 志谢　秦皇岛出入境检验检疫局杨晨光、李德昕、于长利，秦皇岛市工人医院陈爱君及秦皇岛市第三医院感染科及检验科王月娟，中国检验检疫科学研究院卫检所领导及各位同事给予大力支持与帮助，一并志谢.