莱姆病是由伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）引起的一种蜱传疾病，可引起人体多系统、多器官的损害。该螺旋体在自然界的存活依赖于其在宿主动物与媒介之间的相互传播。莱姆病分布广泛，现全世界五大洲70多个国家有莱姆病存在，且发病区域及发病率均呈扩大和上升趋势，该病已被WHO列为重点防治研究对象^[1]。我国自20世纪80年代开始研究莱姆病以来，已经发表百余篇文献，报道了针对莱姆病在29个省（自治区、直辖市）开展的莱姆病血清学调查。被调查人群的血清抗体阳性率为0.22%～44.18%，并从20个省（自治区、直辖市）的患者、动物和/或蜱中分离出病原体，证实我国存在莱姆病的自然疫源地，部分地区还有典型莱姆病病例存在^[2]。

自1991年以来，我国针对莱姆病宿主动物调查包括辽宁、四川、福建、浙江、甘肃、广东、吉林等地，结果显示鼠类平均带菌率约为10%^{[3, 4, 5, 6, 7]}。2009年侯学霞等^[8]在我国6省针对莱姆病宿主动物展开调查，结果显示青海省鼠类带菌率相对较高。因此我们选择在青海省的互助、泽库和祁连县采集啮齿类动物标本，对其伯氏疏螺旋体带菌率进行调查研究。

目前啮齿类动物的伯氏疏螺旋体带菌率检测方法主要为PCR方法，包括普通PCR和巢式PCR。常用的靶基因有5S～23S rRNA基因间隔区、ospA、fla等^{[9, 10, 11]}。因为巢式PCR比普通PCR具有更高的敏感度和特异度，因此得到广泛应用。本研究应用巢式PCR方法对青海省3县啮齿类动物带菌率进行检测。

啮齿类动物标本采集地点位于青海省互助县的北山林场、泽库县的麦秀林场及祁连县的冰沟达坂。在野外放置鼠夹，采集啮齿类动物，并鉴别物种。随后对其解剖，收集肾脏、脾、肝，置离心管内，-80 ℃保存。

DNA 提取试剂盒（DNeasy Blood & Tissue Kit）由德国Qiagen公司提供。引物由北京天一辉远生物工程有限公司合成。PCR相关试剂由天根生物公司提供。

将本实验室保存的PD91菌株于BSK培养基中传代培养，当菌体浓度达到107个/ml时，将全部培养基装至1.5 ml Eppendorf离心管中，30 130×g离心30 min，弃上清液，用0.01 mol/L pH 7.4 PBS洗涤3次，弃上清液，加入100 μl ddH2O重悬，恒温金属浴上100 ℃水煮10 min，最后30 130×g离心5 min，吸取上清液保存于-80 ℃冰箱，备用。

采用DNeasy Blood ∧ Tissue Kit（DNA 提取试剂盒），提取202份标本DNA。 1.4.2　巢式PCR 1.4.2.1　引物设计

引物参照文献^[7]的rrf（5S）-rrl（23S）rRNA基因间隔区巢式PCR引物，引物序列见表 1。

表 1 rrf-rrl间隔区巢式 PCR引物序列 Table 1 Nested-PCR primers of rrf-rrl intergenic spacer gene

表选项

50 μl反应体系：2×Taq Master Mix 25 μl，上下游引物（100 μmol/L）各1 μl，第一轮模板4 μl，第二轮模板0.5 μl。

94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，53 ℃退火45 s（第二轮退火温度为55 ℃），72 ℃延伸45 s，35个循环后72 ℃延伸5 min。

巢式PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪成像拍照。阳性片段约为250 bp。

将巢式PCR产物送北京天一辉远生物工程有限公司测序，并在NCBI网站，应用Blast对序列进行比对分析。

共检测青海省啮齿类标本202份，其中互助县67份，泽库县78份，祁连县57份。应用巢式PCR方法，共检出阳性标本49份，总阳性率为24.26%。其中，互助县阳性率为17.91%，泽库县为34.62%，祁连县为17.54%（表 2），3个县的啮齿类动物伯氏疏螺旋体阳性率差异有统计学意义（χ2＝7.40，P＜0.05）。

表 2 青海省 202份啮齿类动物标本巢式 PCR检测结果 Table 2 Results of 202 Glires tested by nested-PCR

表选项

202份标本中，包括兔形目和啮齿目的鼠兔科、鼠科和仓鼠科的8个鼠种。其中兔形目鼠兔科的鼠兔（Ochotona）共115份，阳性32 份，阳性率为27.83%；啮齿目包括鼠科和仓鼠科鼠种，合计87份，阳性17份，阳性率为19.54%。其中，鼠科有林姬鼠（Apodemus peninsulae）、小林姬鼠（Apodemus sylvaticus）和小家鼠（Mus musculus），共计23份，阳性6份，阳性率为26.09%；啮齿目仓鼠科有仓鼠（Cricetulus）、灰仓鼠（Cricetulus migratorius）、田鼠（Microtus）和鼢鼠（Myospalax），共计64份，阳性11份，阳性率为17.19%。兔形目和啮齿目动物的阳性率均高于我国鼠类宿主动物带菌率的平均水平（表 3）。

表 3 不同啮齿类动物标本巢式 PCR及测序结果 Table 3 Prevalence of B. burgdorferi in different species in 202 Glire samples

表选项

所有阳性样本均送北京天一辉远生物工程有限公司进行测序。测序结果在NCBI网站，利用Blast比对，在49份阳性标本中，有18份测序结果与B. afzelii基因片段相似度为95%～100%，有31份与B. garinii基因片段相似度为95%～100%（表 3）。

莱姆病在自然界的存活，依赖于其在宿主与媒介之间的传播。因此，要了解区域内伯氏疏螺旋体的流行程度，检测其宿主动物的带菌率十分必要。

莱姆病病原体的宿主主要为啮齿动物。美国的主要宿主为北部的白足鼠（Peromyscus maniculatus）和白尾鹿（Odocoileus virginianus）^[12]。在我国和欧洲，普遍认为啮齿目姬鼠属（Apodemus）和鼠平属（Clethrionomys）是主要宿主^[13]。此次从青海省3县共捕捉啮齿类动物202只，共检出阳性49份，阳性率为24.26%，远高于我国鼠类调查的平均阳性率，这对于莱姆病的传播起到重要作用。在本研究中，鼠兔的数量居多，达到115只，伯氏疏螺旋体阳性率达27.83%；而啮齿目动物包含鼠科和仓鼠科的7个鼠种，共87份标本，平均阳性率为19.54%，低于鼠兔阳性率。该结果表明，在青海省鼠兔可能是莱姆病的重要宿主动物。

莱姆病呈世界性流行，在全世界五大洲均有发生。美国自1982年开始监测莱姆病，仅2001－2002年，就有40 792例感染莱姆病^[14]。我国自20世纪80年代以来，已证实29个省（自治区、直辖市）的人群存在莱姆病感染。莱姆病分布广泛，但是疫区相对集中。我国的莱姆病疫区主要在东北部、西北部和华北部分地区。青海省位于我国西部，地处青藏高原的东北部，林区面积广袤，人群莱姆病阳性率较高。我们的采样点分别位于青海省互助县的北山林场，泽库县的麦秀林场和祁连县的冰沟达坂。互助县北山林场是青海省森林面积较大的天然次生林经营林场，地处青海省互助县东北部，祁连山东端，大通河中下游，祁连山支脉冷龙岭南域，支脉达坂山北坡，海拔2100～4308 m，林区总面积11.27万hm2，其中林业用地为10.19万hm2，森林覆盖率为68.40%。麦秀林场位于青海省泽库县东北部，是三江源自然保护区核心区，以高山带原生态为主。祁连县的冰沟达坂位于托来山脉，系祁连山脉中段支脉，山体南面的大通河谷地宽10余公里，若干地段形成盆地或覆有黄土的冲积平原，是祁连山地重要的河谷农业区，此外北大河谷是优良的畜牧业区。在我国，林区人群的感染率可达44.18%，为我国人群平均感染率的5倍还多。本实验中，青海省西北部3县的伯氏疏螺旋体宿主动物平均阳性率为24.26%，远高于我国鼠类调查的平均阳性率，且泽库县的带菌率要高于其他两县，可能与宿主带菌率高，人群活动频繁有关。应进一步对当地的媒介和人群进行调查。

研究表明，伯氏疏螺旋体的4个基因型可以导致人感染伯氏疏螺旋体，分别是B. garinii、B. afzelii、B. burgdorferi sensu stricto^[12]以及最近才发现的能够导致人感染的B. valaisiana^[15]。在本研究中，将巢式PCR第二轮产物测序，通过Blast比对，发现青海省3县啮齿类动物阳性标本的目的基因片段与B. garinii基因型相似度达95%以上的有31份，与B. afzelii基因型相似度达95%以上的有19份标本。提示在青海省啮齿类动物中至少存在两种基因型的伯氏疏螺旋体，应对其进行分离培养，进一步做病原学研究。