河北省北部与内蒙古相接，南面与河南、山东省毗连，西面与山西省相邻，东临渤海，东北与辽宁省相邻，环抱北京与天津市，交通发达，具有重要的地理位置^[1]。1971年12月，河北省首次从长爪沙鼠（Meiionesunguiculataus）体内分离到鼠疫菌，证实了鼠疫疫源地的存在。期间共发生4次动物鼠疫流行，菌型均为鄂尔多斯高原型^[2]。鉴于河北省地理位置的特殊性和鼠疫的严重危害性，深入研究分析该疫源地鼠疫菌的分子遗传特征，具有十分重要的意义。多位点串联重复序列分析（MLVA）首先被国外学者引入鼠疫领域^[3]，利用鼠疫菌基因组中存在不同数目的串联重复序列（VNTR）位点，将鼠疫菌进行分型。张晓嫒^[4]和付秀萍等^[5]曾利用所公布的VNTR位点将鼠疫菌进行分型。由于我国鼠疫菌类型复杂，需要选用更适宜的VNTR位点进行分析。通过对鼠疫菌全基因组序列的比对，本研究采用15个VNTR位点对河北省长爪沙鼠鼠疫疫源地的116株鼠疫菌进行了MLVA，建立该疫源地鼠疫菌的遗传学档案资料，为鼠疫防控提供依据。

实验所用116株鼠疫菌均分离于河北省鼠疫疫源地。1971－1972年分离18株，1994－1995年分离65株，2002－2003年分离27株，2005年分离6株（表 1）。

表 1 实验所用菌株信息 Table 1 The information of stains

表选项

PCR扩增仪（杭州博日科技有限公司）、高速台式离心机（Eppendorf 5424）、水平电泳仪（北京市六一仪器厂）、凝胶成像仪（上海基因有限公司）。

DNA提取试剂盒购自Qiagen公司，PCR扩增试剂购自北京全式金生物技术有限公司，DL500 Marker购自大连宝生物工程有限公司，100 bp Marker购自北京赛百盛基因技术有限公司，琼脂糖购自西班牙Biowest。

引物MLV1～MLV9、MLV11、MLV12、MLV14为中国疾病预防控制中心（CDC）传染病预防控制所设计提供。引物M52、M59和M61从已发表文献中筛选。本研究使用的引物序列信息见表 2。

表 2 引物序列信息 Table 2 The primer information

表选项

冻干菌株经营养琼脂培养基28 ℃ 24～48 h复苏，分离培养，做噬菌体实验，Qiagen试剂盒提取DNA。

去离子水将提取的鼠疫菌DNA模板10倍稀释，采用25 μl反应体系，其中Supermix 12.5 μl，上、下游引物各1 μl，模板1 μl，去离子水9.5 μl。引物MLV1～MLV4的PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min。35个循环。72 ℃延伸5 min。其余11对引物延伸时间为1 min，其他条件同上。

引物MLV1～MLV4的扩增产物采用3%琼脂糖凝胶，其余为2%。120 V，40 min。

利用凝胶成像仪分析系统分析，挑选个别反应进行测序，最后确定扩增长度和重复数目。

同一引物所扩增的不同菌株目标条带长度在同一位置，随机挑选出2个反应由生工生物工程（上海）股份有限公司测序，证实同一引物扩增的产物其长度相同，经MegAlign软件和NCBI在线Blast与CO92基因序列比对得出最后的VNTR重复数（表 3）。

表 3 实验菌株与 CO92的 VNTR的重复数比较 Table 3 The result of repeat number between the experimental strains and CO92

表选项

分别用中国CDC传染病预防控制所提供的15对引物，针对随机选取不同年代分离的菌株进行扩增，所有引物均扩增出目标条带（图 1～3），且针对不同的VNTR位点，产生各自的重复数目。

图 1 引物 MLV4对不同菌株的扩增结果（长度为 732 bp） Figure 1 The amplification result of different strains with primer MLV4

图选项

图 2 引物 MLV1～MLV4分别对 728、9508、0204、0301、0501 菌株扩增结果 Figure 2 The implication results of the strain 728，9508，0204，0301，0501 with MLV1，MLV2，MLV3，and MLV4

图选项

图 3 引物 MLV5～M61 分别对 712、9406两株菌株的扩增结果 Figure 3 The amplification result of the strain 712,9406with primer MLV5-M61

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每对引物均挑选2个扩增结果进行测序，然后采用Blast软件与CO92比对，确定扩增反应的核心序列重复数目，如图 4所示，VNTR位点M59在CO92的重复数目比测序菌株的重复数目少1个，其余各位点核心序列重复数目见表 3。

图 4 M59引物扩增产物序列与 CO92比较 Figure 4 Contrast of the sequence in amplification with M59 to CO92

图选项

实验显示，同一引物针对116株鼠疫菌所得的重复序列均相同，可见分离自河北省境内的菌株同属于一个MLVA型。

MLVA技术在国内被广泛应用于鼠疫菌的基因分型，Zhang等^[6]引用并筛选的10个VNTR位点将我国各个疫源地的鼠疫菌株分为74个基因型，并证明基因型与生态型相吻合；Li等^[7]利用14＋12个VNTR，将我国鼠疫菌进行了更详尽的遗传进化分析；朱俊洁等^[8]筛选出5个VNTR位点将云南省鼠疫疫源地的鼠疫菌分为5个基因型。研究显示MLVA是一种可靠的分型方法，不仅可以将我国鼠疫菌进行科学客观的分型，同时也为研究彼此的亲缘关系和遗传进化特征提供帮助。

河北省长爪沙鼠鼠疫疫源地鼠疫菌生态分型为鄂尔多斯高原型^[9]。在本研究中，针对同一VNTR位点所设计的引物，所有菌株的重复数目均相同，即同属于一个基因型，与其生态型分型相吻合。尽管该疫源地自1972年以来发生过4次较大的动物鼠疫流行，但其鼠疫菌MLVA遗传特征仍然是稳定的。本研究通过所获得的数据，建立了河北省鼠疫菌MLVA数据库，这些将对未来的鼠疫疫情调查和应急处理提供技术支持。

河北省鼠疫菌株在生物分型中属于中世纪型^[10]，也即甘油阳性而脱氮实验阴性，在本研究中，同一菌株不同引物扩增的长度和重复数目，有些与CO92不同，也即生物型不同其基因型也不同。本研究通过与全国鼠疫菌MLVA比对，可进一步对河北省鼠疫疫源地菌株进化过程分析提供依据。

将来自于内蒙古长爪沙鼠鼠疫疫源地的菌株99082、99103与河北省菌株比较，发现就同一引物扩增，目标条带并不在相同的位置，显示尽管它们为同一疫源地的鄂尔多斯型菌株，但是仍然在进化过程中有一些不同的变化，这与之前的生化实验结果不一致，分离自两地的菌株其对蜜二糖和麦芽糖的酵解能力也不同^[9]，可见MLVA更能详尽准确地将菌株分型并做进化分析。