蚊传病毒是通过蚊虫叮咬敏感脊椎动物导致人畜患病的一类病毒，蚊虫携带传播病毒但自身不患病^[1]。国内外已报道多种对人畜致病的蚊传病毒，其中已证实在我国存在和流行的包括流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）、登革热病毒（Dengue virus，DENV）及Tahyna病毒（Tahyna virus，TAHV）^{[1, 2]}。河南省地处北亚热带、暖温带地区，四季分明，夏日炎热，降雨充沛，适宜的生态环境有利于蚊虫孳生。对河南省病毒性脑炎的流行病学监测结果显示，在蚊虫活动高峰的夏秋季节，当地存在病毒性脑炎患者^[3]。本研究对河南省部分地区开展蚊虫调查和病毒分离，以掌握当地蚊虫及蚊传病毒分布特点和类型，为相关疾病的预防控制提供病原学依据。

于2012年5－8月在洛阳市新安县磁涧镇的尤彰村和李村镇的晁庄村选择树林、牛棚和居民住房捕捉蚊虫；2012年8月期间在信阳市息县城郊乡新铺村、何店村的居民住房和猪圈中采集蚊虫。采用电动吸蚊器（DX-3型，慈溪市亚细亚卫生杀虫药械厂生产）和人诱法（蚊帐）相结合的方法采集蚊虫标本。在人房、牛圈和猪圈等环境采用电动吸蚊器采集蚊虫；在村庄周围的树林中采用人诱法捕捉蚊虫。每天采集时间为19：00－20：30。将采集到的蚊虫置-20 ℃冰箱冷冻，之后解剖镜下分类鉴定和计数分装，随后立即液氮冻存。

使用细胞培养法分离病毒。首先从液氮中取出装标本的冻存管，迅速将蚊虫倒入已编号并预冷的2 ml无菌平底离心管中，加入1.5 ml无血清MEM液（含8%双抗），用组织振荡仪Tissue lyser（QIAGEN，Germany）研磨至蚊虫组织碎片消失为止。将研磨液在4 ℃条件下以18 000×g离心30 min，取上清150 μl接种于生长成单层的BHK-21细胞和C6/36细胞的24孔细胞培养板，并分别于37 ℃和28 ℃的CO2孵箱中培养，连续培养6 d，逐日观察并记录细胞病变（CPE，cytopathic effects），当CPE达到++++时收获，反复冻融3次，以充分裂解细胞释放病毒，离心取上清液再次接种正常细胞，依此法连续盲传3代，无病变者剔除。

通过反转录-聚合酶链反应（RT?PCR）法及序列分析法鉴定病毒。用Viral RNA Mini Kit（QIAGEN，Germany）从阳性分离物上清中提取病毒总RNA，操作流程参照试剂盒说明书；使用Invitrogen公司 “SuperScriptTMⅢFirst?Strand Synthesis System for RT?PCR”试剂盒及随机引物Oligo（dT20）反转录获得cDNA；取2 μl cDNA作为模板，使用TaKaRa公司GoTaq Green Master Mix，以及本室常规鉴定引物进行PCR扩增，引物信息详见表 1。反应结束后以1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，回收阳性PCR产物并测定产物序列信息（北京博迈德科技发展有限公司完成）。

表 1 鉴定用引物信息 Table 1 Detailed background of the primers used in this study

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注： 兼并引物信息 M. C/A； W. A/T； Y. C/T； K. G/T； R. G/A； V. G/A/C； D. T/A/G； Flavivirus. 黄病毒属； CppDNV. 淡色库蚊浓核病毒； JEV. 乙脑病毒。

使用DNAMAN软件进行测序结果的序列拼接、编辑及校正；用Clustal X2.1软件进行序列比对；用DNAStar软件包的MegAlign软件完成核苷酸差异度分析；应用Mega v5.1生物信息学软件构建系统进化树（Neighbor?Joining法，自展值为1000）。

2012年夏季在河南省共采集4属5种7149只蚊虫标本。其中洛阳市新安县采集蚊虫标本4001只（4001/7149，55.97%）；信阳市息县共采集蚊虫标本3148只（3148/7149，44.03%）。两县优势蚊种各不相同，新安县骚扰阿蚊（Armigeres subalbatus）居多（2055/4001，51.36%），其次包括淡色库蚊（Culex pipens pallens）（1019/4001，25.47%）和三带喙库蚊（Cx. tritaeniorhynchus）（909/4001，22.72%）；而息县以淡色库蚊为优势蚊种（2964/3148，94.16%）。淡色库蚊是唯一在两个城市均能采集到的蚊种。

将7149只蚊虫标本按照采集地和蚊种，分为170批研磨，标本研磨上清液接种BHK-21和C6/36单层细胞，连续盲传3代，获得5株轻微病变分离物（背景信息见表 2）。5株分离物均能导致C6/36细胞产生轻微CPE，表现为培养72 h后出现个别圆肿细胞（图 1A），但直至培养第6天仍不发生聚集、脱落等病变特征，对BHK-21细胞不能导致CPE（图 1B）。将阳性分离物的C6/36细胞第3代培养物上清接种BHK-21细胞，发现48 h左右出现明显CPE，病变特征为不规则缩小，72 h 80%细胞发生病变并逐步脱落（图 1C）。

表 2 阳性分离标本的详细背景资料 Table 2 Detailed background of the positive isolates

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图 1 阳性分离物 HNXA55 在细胞培养中的病变特征 Figure 1 CPE caused by inoculating isolates HNXA55 in C6/36 and BHK-21

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5株阳性分离物均来自于库蚊属蚊虫，结合其细胞培养特征，使用针对黄病毒属、JEV和CppDNV的特异引物对阳性分离物进行RT?PCR扩增。结果提示5株病毒均为JEV（图 2A），病毒在经C6/36细胞传代培养过程中确实实现了量的扩增，并且将其第3代C6/36细胞培养物上清液转接BHK-21细胞后，培养中发生了明显的病毒增殖（图 2B）。

图 2 特异引物扩增新分离 JEV的 E 基因区段 Figure 2 RT-PCR amplification for E gene of new JEV isolates

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将5株JEV的基因序列提交GenBank比对，下载相关国内外毒株序列构建数据集，完成核苷酸同源性和系统进化分析。基于E基因序列的系统进化分析表明，目前已知JEV共分5个基因型，本研究获得的5株新分离JEV均为基因Ⅰ型，与山西省2009年（SX09S-01）和2012年（12LY039）分离株遗传关系最接近，其次与其较亲缘的毒株为辽宁省2007年分离株XJ69和江西省2008年分离株JX61，以上JEV毒株位于同一进化簇中（图 3）。

图 3 JEV分离株的 E 基因系统进化分析 Figure 3 Phylogenetic analysis of JEV isolates based on E gene sequences

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分析各毒株E基因序列同源性发现，河南省新分离株核苷酸一致性为98.6%～99.9%，其中HNXA55与HNXA60同源性最高达到99.9%；5株病毒氨基酸同源性为99.8%～100%，HNXA29、HNXA55、HNX10和HNX27的氨基酸同源性为100%；与河南省2004、2007年分离株相比，同源性分别为97.7%～98.0%和98.0%～98.3%；同基因Ⅰ型的其他JEV比较，与HEN0701、GZ56、SX09S-01、12LY039E氨基酸同源性最高均为99.8%。2012年河南省新分离株与我国目前使用的减毒疫苗株SA14-14-2之间存在11个共同差异位点（图 4红框标示），HNXA60自己有一个独特的位点E256（甘氨酸G→E谷氨酸）；第76位氨基酸处，仅GP78和p3株为M（甲硫氨酸），包括河南省新分离JEV在内的其他毒株，此处均为T苏氨酸（图 4蓝框标示）。

图 4 新分离 JEV的 E 基因氨基酸比较 Figure 4 Comparison of E gene amino acid sequences of JEV Henan isolates

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流行性乙型脑炎（乙脑）是全球最严重的病毒性脑炎，病死率为35%～40%^{[4, 5]}。目前发生并流行于亚太地区24个国家范围内^[6]，中国是乙脑的主要流行区。河南省长期以来属于我国乙脑高发省份，每年报告病例均位居前列^{[7, 8]}。对河南省1950－2010年的乙脑监测统计分析显示，乙脑流行疫区主要分布在南部及东南部淮河流域平原盆地，疫情流行程度依地理分布南强北弱，7－9月为乙脑高发期^{[3, 9]}，近年来洛阳、信阳和南阳市成为河南省乙脑高发区，发病人数达该省总病例数的60.12%^[3]。在2012年5月对洛阳市新安县和信阳市息县开展的乙脑发病率调查中^[10]，两个县5岁以下儿童均有乙脑病例，其中新安县出现低年龄组（＜5岁儿童）和高年龄组（＞40岁）发病率均较高的“双峰现象”，＞80岁人群发病率达到26.93%^[10]。上述结果提示目前河南省自然环境中存在JEV的活跃循环，蚊虫叮咬是该病毒传播的主要途径，但2010年以来当地未能从自然生境的蚊虫中分离到JEV。

本研究从河南省新安县和息县采集的淡色库蚊和三带喙库蚊（表 2）标本中最终鉴定分离到5株JEV，通过E基因氨基酸具体差异比较可以发现，河南省新分离株与减毒疫苗株SA14-14-2存在11个共同差异位点，比较E基因编码蛋白的8个重要位点（E107、E138、E176、E177、E264、E279、E315和E439）可知，河南省新分离株的神经毒力并未下降^{[11, 12, 13, 14]}，同时在E52、E270、E306位点处也与SA14-14-2一致^{[15, 16]}，提示新分离株同样具有较弱的神经侵入力。此外，国外有报道称E76位点改变（T转变为M）可导致病毒融合能力降低而致病变延迟^[17]，本研究中虽然新分离病毒株存在细胞培养时增殖异常、缓慢现象，但其E76位点并未发生氨基酸改变。自　2004年王环宇等^[18]从南阳市唐河县蚊虫中分离到1株JEV并鉴定为基因Ⅰ型之后，2006、2007年也分别有从河南省的蚊虫和猪中分离到基因Ⅰ型JEV的报道^{[19, 20]}。本研究自2012年采集的河南省库蚊中分离到5株基因Ⅰ型JEV，与以往报道一致，提示目前河南省自然界中循环的JEV仍以基因Ⅰ型为主。

值得注意的是，新分离JEV毒株均为将标本接种C6/36细胞传代培养后，才导致BHK-21细胞发生典型CPE，同时病毒本身在C6/36细胞传代过程中虽增殖，但CPE不明显。结合PCR扩增实验可以确定新分离毒株是经过C6/36细胞传代培养增殖后，才可在BHK-21增殖，其可能的深层次原因有待于进一步实验研究。C6/36细胞来自于白纹伊蚊（Aedes albopictus）卵细胞，对蚊媒病毒更加敏感而被广泛用于蚊传虫媒病毒的培养^{[21, 22]}，哺乳动物细胞BHK-21常被结合使用以分离对哺乳动物敏感的虫媒病毒。但本研究中发现，按照常规操作分别接种标本于2种细胞后，C6/36细胞CPE不明显、BHK-21细胞不病变的情况可能会错过获得阳性分离物，从而影响标本检测结果和结论。提示实验室检测人员，在从标本中分离JEV的过程中，最好增加将标本C6/36细胞培养物转接BHK-21细胞观察CPE的环节，并结合组织细胞培养和RT?PCR方法，增加病毒的检测及分离概率。