疟疾是世界上主要的公共卫生问题之一，根据WHO发布的《2013年世界疟疾报告》显示，2012年报道全世界大约有2.07亿疟疾临床病例，造成约62.7万例死亡，估计仍有34亿人有感染疟疾的风险^[1]。在非洲，恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）每年导致约500万例疟疾^[2]。在世界其他地区，每年报告的间日疟原虫（P. vivax）发病率在75万～90万例^[3]。目前尚无有效、安全可用的疫苗对疟疾流行进行预防，因此在流行区疟疾的防控主要通过使用经杀虫剂处理的蚊帐和室内喷洒杀虫剂控制。杀虫剂的长期、连续、大量使用导致污染环境和抗药性的产生。因此，有效地控制和预防疟疾，疫苗的研制是必需的。

2011年，malERA在PLoS Medicine上提出开发疟疾疫苗是根除疟疾的基本方法^[2]。疟疾疫苗的研究是必不可少的^[4]。经典的传播阻断疫苗（transmission blocking vaccine，TBVs）^[5]是以疟原虫的有性阶段为靶标，干扰和/或阻止疟原虫在蚊体内的发育，使个体获得免疫而阻断疟疾的传播。目前，研发的几种TBVs已经成功地在动物体内进行了试验，并取得较大的研究进展^[6]。最近，研发的干扰疟疾传播的疫苗不仅针对有性阶段，而且针对疟原虫的其他发育阶段，这种疫苗称为干扰疟疾疫苗（vaccines that interrupt malaria，VIMT），VIMT可以由以下一个或多个成分组成：经典的TBVs针对疟原虫有性阶段和蚊虫发育阶段；红细胞前期疫苗，减少无性和有性阶段疟原虫感染；无性阶段红内期疫苗，主要抑制无性阶段疟原虫，有效地降低血液阶段疟原虫密度，影响疟疾传播；针对带虫者抗原的疫苗，以扰乱带虫者体内疟原虫的发育^[3]。现就近年来干扰疟疾疫苗及其靶抗原的研究进展、生物安全状况和存在的问题与展望进行综述，旨在为疟疾疫苗的研究提供参考。 1 传播阻断疫苗 1.1 靶抗原

疟原虫通过按蚊感染人体有复杂的生活史。此期间需要疟原虫与宿主和载体组织之间特定分子的相互作用。TBVs就是通过对疟原虫的动合子穿过蚊虫中肠上皮细胞时的分子间相互作用的认识，阻断疟原虫的生活史，从而减少疟疾的传播。疟原虫在按蚊体内发育阶段的雌雄配子、合子和动合子所表达的表面蛋白是研制TBV的重要靶抗原。目前研究较多的是恶性疟原虫相关的恶性疟原虫子孢子囊表面膜蛋白（Plasmodium falcipaum surface protein，Pfs25）^{[7, 8, 9, 10, 11]}、Pfs28^{[12, 13]}，间日疟原虫蛋白（Plasmodium vivax proteins，Pvs25）^{[14, 15]}、Pvs28^[16]等。 1.2 Pfs25

Pfs25是恶性疟原虫配子体内含有的特异性抗原，其中一些表达在新出现的雌配子的表面上。传播阻断抗体的目标就是在雌配子受精和动合子到卵囊发育的有效配子发生后的这些抗原。当蚊虫吸血时，TBVs诱导抗体，扰乱疟原虫在蚊体内的发展^[7]。所以有些研究者通过寻求开发一种TBVs，主要针对发生在蚊虫中肠疟原虫的表面或有性阶段的分泌蛋白来达到阻断传播疟疾的目的。

Pfs25是相对分子质量为25×10³的富含半胱氨酸的蛋白^[8]。在疟原虫配子体的表面表达，并持续存在于合子和动合子阶段，其抗体可以抑制动合子在蚊虫中肠内的发育，从而起到传播阻断疟疾的效果，是有效的传播阻断抗原^[9]。陈勇等^[10]通过GenBank中的Pfs25基因序列，利用毕赤酵母（Pichia membranaefaciens）密码子分析人工合成目的基因，采取定向克隆策略，构建重组表达质粒Pfs25/pGAPZαA，经BstXⅠ线性化，电转染法转化酵母菌株GS115，在Zeocin抗性的选择培养基上获得含有目的基因的Pfs25/pGAPZαA/ GS115重组酵母菌，经验证可以得到稳定的遗传，为研制基于Pfs蛋白的传播阻断型恶性疟疾疫苗奠定了基础。Gregory等^[11]从藻类的叶绿体中提取和纯化的重组Pfs25接种到小鼠体内，通过实验表明可以有效地防止疟疾传播。且藻类生长成本较低，繁殖时间较短，并且不会产生病毒等污染，是理想的恶性疟疾候选疫苗。 1.3 Pvs25

Pvs25是间日疟原虫动合子表面的一种主要表达蛋白，对动合子在蚊胃内的存活与发育起着重要作用^[14]。该分子目前被认为是研制和开发间日疟原虫TBVs首选的疫苗候选抗原。它的蛋白基本结构是：N末端和C末端有短的疏水区，分别被认为是信号肽段及糖基化磷脂酰肌醇（GPI） 信号，中间是4个富含半胱氨酸残基称之为表皮生长因子（EGF）样的功能区序列，并具有B细胞表位。

Pvs25H疫苗是从间日疟原虫动合子的Pvs25表面抗原衍生的重组蛋白。该蛋白在酵母中表达，用铝胶吸附和纯化。用ELISA法测定抗Pvs25H抗体的水平在接种后第3天达到顶峰。疫苗诱导的抗体功能活跃，可见此试验显著增加传播阻断的活性。抗体浓度和抑制程度之间有相关性。Pvs25H在人体抗间日疟原虫中产生传输阻断免疫，显示出该抗原作为传输阻断疫苗组分的潜力^[15]。 1.4 Pfs25和Pfs28融合疫苗

Pfs28是恶性疟原虫动合子的一个28×10³的表面蛋白^[12]。研究表明，Pfs28与Pfs25抗体的结合可以增加传播阻断疫苗的效果^[13]。Pumilio/FBF（PUF）家族RNA结合蛋白，PfPuf2，是一种RNA结合蛋白，可以通过结合靶mRNA〔Pfs283′非编码区（UTR）和Pfs25的5′端非编码区〕的PUF结合元件（PBE），控制TBVs候选Pfs25和Pfs28的翻译抑制。Miao等^[16]通过实验表明，PfPuf2可以控制恶性疟原虫在人和蚊虫之间传播。 1.5 Pvs25和Pvs28融合疫苗

Pvs28是P21/28的亚家族成员。氨基酸序列分泌的信号序列为4表皮生长因子（EGF）样结构域，六拷贝的七肽氨基酸重复序列（GSGGE/D）和一个短的疏水性区域^[17]。对于间日疟原虫，Hisaeda等^[18]利用PCR，以间日疟原虫的基因组DNA为模板，扩增后的PCR产物和质粒YEpRPEU-3通过 NheⅠ和ApaⅠ限制位点进行连接。得到的产物进行转化和克隆，上清液用过滤的方法进行纯化，通过对小鼠腹膜内进行接种，用ELISA进行稀释，检测接种效率。并将感染的末梢血提供给4种蚊虫，通过显微镜计数中肠中形成的卵囊数。此种方法不是消除在人体内数以千亿计的红细胞无性阶段疟原虫，而是减少蚊虫摄入疟原虫的数量，研究表明，TBVs可以使卵囊在蚊体内的形成少于10个。重复实验表明Pvs25和Pvs28可以阻断间日疟原虫的传播。 2 疫苗与佐剂

佐剂的研究是一个充满活力和快速发展的领域，是一种安全的和可负担得起、可以有效地增强免疫活性的方式^[19]。在疟疾疫苗的研究中佐剂或载体是必不可少的组成部分。 2.1 疫苗与免疫佐剂结合

2.1.1 人工合成的Pfs25与细菌肽聚糖的胞壁酰三肽（muramyl tripeptide，MTP）结合

MTP是微生物免疫佐剂的一种，是从分枝杆菌细胞壁中分离得到的具有活性的结构片段，能够增强体液免疫和细胞免疫，提高对疫苗的保护力，被认为是最有发展前途的佐剂之一。Barr等^[20]利用从酵母分泌合成的Pfs25类似物与构象依赖性单克隆抗体反应，在与佐剂MTP结合时用于免疫小鼠和猴，证明Pfs25与MTP结合可以引起传播阻断抗体反应。 2.1.2 结合免疫佐剂Montanide ISA 51的Pfs25 and Pvs25的传播阻断候选疫苗

Montanide ISA 51属于含有表面活性剂和油类的矿物油性佐剂。Wu等^[21]利用巴斯德毕赤酵母和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在酵母表达系统重组蛋白Pfs25和Pvs25，加入hexa?His tag到重组蛋白的C-末端，以促进其纯化和保留活性。用新西兰白兔进行毒理学研究，通过不同剂量的接种，对疫苗进行评估。并招募了华盛顿地区18～50岁的健康男性和非妊娠女性，进行第一阶段的临床试验，评估疟疾传播阻断疫苗候选Pfs25/ISA 51和Pvs25/ISA 51在健康美国成年人中的安全性和免疫原性。结果表明，在诱导传播阻断免疫中，使用Pfs25/ISA 51作为人类疫苗是有效的，但这些疫苗会产生局部反应和全身不良反应，这些反应与特定抗原的Montanide ISA 51制剂之间有一定的关联。在接受预定最低剂量Pfs25/ISA 51的志愿者体内产生的传播阻断抗体表明了这种方法的可行性。然而，本研究中发现的局部反应，并结合所观察到的全身性反应的严重程度和持续时间，使Montanide ISA 51的制剂暂时不适于临床应用。

最近的研究表明，在第一阶段人体试验中，利用重组的人类Pfs25特异性抗体Pfs25H/Montanide ISA 51阻断疟原虫感染蚊虫，其阻断的程度可能不足以作为有效的TBVs^[7]。 2.2 多糖与载体蛋白结合

多糖与载体蛋白结合一直是生产安全有效疫苗成功的方法。Qian等^[22]通过铜绿假单胞菌胞外蛋白A（Pseudomonas aeruginosa ExoProtein A，rEPA）连接质粒pVC45D/PE553D，在大肠埃希菌细胞BL21（λDE3）中进行转化，克隆后在培养基中加入异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷，以诱导重组rEPA的表达。上清液经过纯化后，使用pVC45D/PE553D作为模板，以exoA?NF和exoA?SR为引物进行基因扩增。扩增后的rEPA与pfs25进行结合，对小鼠进行接种，观察免疫原性。结果表明偶联rEPA的小鼠Pfs25的抗体效价有显著改善。

Kubler-Kielb等^[23]为了增加Pfs25的免疫原性，研究了Pfs25对其本身和其他蛋白结合的几种方法：重组铜绿假单胞菌外毒素A和卵清蛋白、酰胺、腙或硫醚键结合，通过免疫观察传播阻断活性和通过ELISA测定抗体水平，表明所有的偶联物在小鼠体内都能增加其免疫原性和诱导反应，该方案通过使用己二酸二酰肼作为连接形成蛋白质之间的酰胺键产生偶联物的免疫原性最强。使用氢氧化铝吸附该偶联物可以进一步增加抗体的应答。通过结合的偶联物具有以下性质：Pfs25的偶联物在2～10 mol/L（50×10³～250×10³）的组成似乎是最好的免疫原；增加Pfs25偶联物的每次注射剂量从2.5～10.0 μg丝毫不影响抗体的水平；吸附的该Pfs25结合物在氢氧化铝增强其免疫原性。也有研究表明Pfs25H结合在脑膜炎奈瑟球菌的外膜蛋白复合物上，不仅提高了抗体浓度，而且延长了抗体生物活性的持续时间^[24]。 2.3 AdPvs25

AdPvs25是基因工程表达的复制缺陷型人类腺病毒血清型5（RAD）的疟原虫动合子表面蛋白（OSP）。Miyata等^[25]对BALB/c小鼠通过各种途径包括肌内、皮下和鼻内途径免疫AdPvs25诱导抗原特异性的传播阻断免疫。结果显示，赋予抗血清的蚊虫平均卵囊数减少高达99％，表明具有种特异性的传输阻断免疫诱导，且AdPvs25的疫苗效力比重组蛋白Pvs25与氢氧化铝混合略高。通过实验表明AdPvs25是一个潜在的疟疾TBVs抗原的病毒载体系统。 3 其他VIMT

针对疟原虫生活史中子孢子侵入宿主（人）肝细胞、裂殖子侵入红细胞、动合子进入蚊虫中肠上皮细胞研发疫苗，干扰其生活史，从而阻止疟原虫的传播^[4]。 3.1 针对红细胞前期和无性阶段

有效的红细胞前期疫苗能降低血液中疟原虫，既包括无性阶段虫体也包括配子体。这种疫苗可以提供保护力，降低疟疾的传播。基于子孢子蛋白的重组疫苗（RTS，S）已被证明能引起部分保护作用，防止恶性疟原虫的感染^{[26, 27]}。 3.2 针对带虫者，以减少疟疾传播

木菠萝凝集素通过屏蔽蚊虫肠上皮细胞表面的糖蛋白聚糖配体，抑制动合子附着。Dinglasan等^[28]报告了作为蚊虫中肠上皮表面的主要木菠萝凝集素的目标冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）氨肽酶N（AgAPN1）的分子特征，并为动合子入侵机制提供了证据。实验表明α-AgAPN1 IgG抗体强烈抑制恶性疟原虫和间日疟原虫在不同蚊种的发展，证明AgAPN1在动合子入侵肠壁细胞中起保护作用。疫苗诱导杀虫的活性可以大大减少某些蚊虫传播疟原虫的能力，特别是对非洲疟疾媒介，如冈比亚按蚊^[29]。 3.3 宿主-疟原虫和蚊的相互作用

子孢子表面蛋白如环子孢子蛋白（CSP）和血小板反应蛋白相关蛋白（TRAP）已被证明在肝细胞中发挥针对裂殖子抗原的结合和侵入作用^{[30, 31, 32]}，175×103的红细胞结合抗原（EBA175）抗体^{[33, 34]}、Duffy结合蛋白（Duffy binding protein，DBP）^[35]和PfRH蛋白^[36]，起着调解与红细胞受体相互作用的功能，能抑制血液中的疟原虫。与蚊虫肠壁相互作用的动合子抗原也可以用作重组疟疾疫苗的候选物，对阻止疟原虫在蚊体的传播具有作用。 4 干扰性疟疾疫苗研发存在的问题与趋势

由于疟原虫生活史复杂，在人体内绝大部分时期都寄生在宿主细胞内，抗原具有高度特异性和变异性，使疟原虫具有多种入侵途径和逃避机体的免疫攻击机制，因此，疟疾疫苗的研制比其他传染病疫苗更为困难^[37]。TBVs是以疟原虫在蚊体内特异性表达的表面蛋白作为抗原来免疫人体，使之产生抗蚊虫体内疟原虫表面蛋白的特异性抗体。蚊吸入被免疫的人血后，使其在蚊胃内发育的疟原虫与人的抗体发生抗原抗体反应，阻滞蚊体内疟原虫的发育，从而阻断疟疾在蚊虫与易感人群之间的传播^[38]。与红细胞前期、红内期疫苗候选抗原比较，TBVs候选抗原的特点在于抗原变异少，这对疟疾疫苗的研制开发具有重要意义。然而，VIMTs包括红细胞前期和/或无性阶段的疫苗，这些阶段的疫苗也可以为易感人群提供保护，达到防止疟疾的目的。在经过多年的累积消除后，如果疟疾重新在没有抗疟疾免疫力的人群中暴发，通过红细胞前期和/或无性阶段的疫苗也可以防止疫情蔓延^[34]。RTS、S疫苗是针对该期的领先性疫苗，目前已进入第3期临床试验，其能对配子体发生率有显著的影响并影响疟疾的传播，从而达到阻断疟疾传播的目的。

随着疫苗学及基础免疫学的飞速发展，新型佐剂的研发与应用面临着巨大挑战，然而对佐剂的作用机制认识仍不够深入，使得新型佐剂的进一步发展困难重重，例如，Pvs25和Pfs25与ISA51结合试验被终止，就是因为不可接受的反应原性，使Montanide ISA 51的制剂不可能进一步的发展^[21]。但也有学者认为在干扰性疟疾疫苗的研究中，新型佐剂的安全性、有效性、选择性和可控性的有机结合将成为疫苗发展的必然趋势，不过必须对疫苗与佐剂中新的抗原及佐剂的组合进行仔细的研究和设计^[39]，使其能够诱导强烈的免疫反应耐受，减少副作用的产生。 5 结 语

综上所述，TBVs的抗原变异少，易于疟疾疫苗的研制和开发，但手段单一，对疟原虫的多种入侵途径和逃避免疫机制的防范力度较弱。疫苗与多种佐剂的结合均可以达到增强免疫原性，提高抗体产生的浓度，延长抗体生物活性的持续时间，但佐剂的加入有时会导致不可接受的反应原性增强，故对于疟疾疫苗的研制应寻找新的、有效的候选疫苗抗原，或寻找通过与其他的新型佐剂结合，以达到增强安全性和免疫原性，增加抗体活性的持续时间，减少不良反应产生的目的。