板栗（Castanea mollissima）属于壳斗科栗属落叶雌雄异花同株的植物，原产中国，是世界著名的干果树种。板栗树的雄花远多于雌花，因此，板栗花一般指的是其雄花序。近年来随着板栗种植面积的不断增加，板栗花作为板栗生产的副产物其产量十分可观^[1]。板栗花不仅香气怡人，而且有很强的驱避活性。早年民间有采用落地板栗花，将其拧成草绳晒干，通过燃烧产生的烟雾来驱蚊。近年来，随着对板栗花研究的不断深入，板栗花在淀粉、多糖、氨基酸、黄酮、精油研究方面已有报道，并且有板栗花蒸馏液做空气清新剂的应用^{[2, 3, 4]}。

目前广泛使用的驱蚊剂，如花露水，是一种以避蚊胺（DEET）为主要有效成分的乙醇水溶液。DEET是目前广泛使用的最有效的广谱驱避剂，然而当使用不恰当时，会出现毒性问题，尤其是高浓度重复使用，近年来出现了一些由于使用花露水而引起过敏的病例^[5]。同时，由于花露水中含有大量的乙醇（70%～75%），使其在使用过程中会出现诸如皮肤干燥、容易老化和产生皱纹等副作用，对婴幼儿副作用更为突出^{[5, 6]}，同时还有发生火灾等潜在的危害。因此，研究和开发毒副作用小的天然植物驱避剂已成为相关领域的研究热点。本研究以板栗花为原料，采取水蒸汽蒸馏法获取精油，并对精油的成分进行分析；同时以白纹伊蚊（Aedes albopictus）为供试试虫，研究精油组分的驱避作用，确定有效成分；并通过对板栗花蒸馏液的复配和有效组合，得到高效无醇花露水，为开发成毒副作用小、无醇天然植物驱避剂的花露水提供技术参数。 1　材料与方法 1.1　实验材料 1.1.1　试虫来源

选5～8 d未吸血白纹伊蚊雌虫供试，虫卵由军事医学科学院养虫室提供。饲养温度（28±1）℃，相对湿度（70±5）%，光暗比14∶10（L∶D），幼虫饲以小白鼠饲料，羽化成虫供以6%葡萄糖水。 1.1.2　板栗花蒸馏液与精油

采取水蒸汽蒸馏法获得蒸馏液，以晚期鲜板栗花为原料，液料比为6∶1，蒸汽压力为40 kPa，蒸馏2.50 h条件下制得，由唐山迁西板栗花研究所提供。板栗花精油是以蒸馏液为原料，用正己烷液萃取，收集有机相后经无水硫酸钠干燥过夜，旋转蒸发即得精油，所获得的板栗花精油为浅黄色油状液体，具有浓郁的板栗花特殊味道。 1.1.3　试剂

香叶醇、薄荷醇、松油醇、芳樟醇（分析纯），均购自上海晶纯生化科技有限公司。 1.2　实验方法 1.2.1　样品驱避有效时间测定

攻击力实验。实验参照GB/T 13917.9-2009方法。具体操作：在长×宽×高为40 cm×30 cm×30 cm的蚊笼内放入300只试虫，测试人员手背暴露皮肤4 cm×4 cm，其余部分严密遮蔽后伸入蚊笼中停留2 min，密切观察，发现蚊虫停落，在其口器刺入皮肤前抖动手臂将其驱离，记为1只试虫停落。前来停落的试虫多于30只的测试人员和试虫为攻击力合格，此人及此笼蚊虫可进行驱避实验。在攻击力合格的志愿人员（实验前和实验期间不应饮酒、茶或咖啡，不应使用含香精类的产品）双手背上各画出5 cm×5 cm的皮肤表面，一只手按1.5 μl/cm²的剂量均匀涂抹药剂，暴露其中4 cm×4 cm的皮肤，严密遮蔽其余部分，另一只手为空白对照。将手伸入攻击力合格的蚊笼中2 min，观察有无蚊虫前来停落吸血，间隔一定的时间测试，只要有1只蚊虫前来吸血即判为驱避剂失效，记录蚊虫第1次停落的时间，认定以上测试时间为100%保护时间，即为测试样品的有效驱避时间。每次对照手先做对照测试，攻击力合格的试虫可继续实验，试虫攻击力不合格则需要换合格试虫进行实验。 1.2.2　样品驱避率的测定

蚊虫的饲养环境和样品的处理方法同1.2.1。将测试样品涂抹若干时间后，记录不同处理组与对照组蚊虫叮咬次数，并按照下列公式计算得到样品的驱避率。

精油的含量一般在花露水中所占1%～3%，是大众可接受香味浓度范围，因此控制精油总用量＜3%。本实验首先采用单因素梯度实验研究板栗花精油多种单一组分用量对驱蚊时间的影响，然后对这些因素进行4因素3水平正交实验进行研究，探索出最佳驱蚊时间的配比。 1.2.4　精油成分分析

所用板栗花精油样品经无水硫酸钠干燥、0.2 μm膜过滤后，利用气质联用法（GC-MS）分析。采用气相色谱质谱分析法，气相色谱-质谱测定条件：SE-54型石英毛细管柱（0.25 mm×30 m×0.25 μm），进样口温度250 ℃，检测器温度280 ℃。柱箱温度采用程序升温控制50 ℃→230 ℃，10 ℃/min；然后由230 ℃→280 ℃，20 ℃/min；最后在280 ℃条件下维持10 min。用高纯氦气作载气，流速1.0 ml/min，分流比1∶30，进样量0.4 μl。质谱条件：用70 eV的EI源，倍增电压1.6 kV，发射电流50 A，传输线温度240 ℃，离子源温度250 ℃，质量扫描范围50～450 m/z。 1.3　数据处理

根据实验的设计方法和统计学分析原理，利用Excel软件对实验所得结果进行分析。 2　结　果 2.1　板栗花挥发油的GC-MS分析

从图 1和表 1可以看出，平头峰为萃取剂正己烷，板栗花精油是多种化合物的混合物，这些化合物构成板栗花精油中活性组分，主要为醛、酮、醇、酯类化合物。其中，酯类化合物有2种，醇类化合物有5种，醛类化合物有4种，酮类化合物有1种。

图 1 板栗花精油GC-MS总离子流图 Figure 1 A GC-MS total ion chromatogram of essential oil from chestnut flower

图选项

表 1 板栗花精油的组成成分 Table 1 Major components of essential oil from chestnut.

表选项

醇类、醛类、酯类化合物一般是带香气低沸点的化合物，具有高流动性。其丰度和种类不同，会赋予精油不同的香气。 2.2　板栗花精油对白纹伊蚊有效驱避时间的确定

板栗花精油对白纹伊蚊的驱避活性见表 2。由表 2可知，实验组涂药后3.0 h，对白纹伊蚊有100%的驱避活性，而市售花露水对照组只有2.0 h。当时间延长至3.5 h，板栗花精油的驱避率为96.40%，对照组仅为70.50%，远高于市售花露水的驱蚊时间。

表 2 板栗花精油对白纹伊蚊的驱避活性 Table 2 The repellent activity of essential oil from chestnut flower against Ae.

表选项

板栗花精油具有很强的驱避活性，并含有多种不同的化学成分，在实际应用中，精油一般不能直接作用在皮肤上，通常是稀释后使用。本实验制备的板栗花蒸馏液具有板栗花的特殊香气，因此，对其驱避活性进行研究，同时分别测定精油的4种有效单一组分芳樟醇、松油醇、香叶醇、薄荷醇的驱避活性，实验结果见图 2。

由图 2可以看出，精油的有效单一组分芳樟醇、松油醇、香叶醇、薄荷醇的有效驱蚊时间分别为3.75、5.00、6.00、4.25 h。而水的有效保护时间为0 h，板栗花蒸馏液有效保护时间为0.08 h，市售隆力奇驱蚊花露水的有效保护时间为2.25 h。因此精油中的4种单一有效成分均有很强驱蚊效果。板栗花蒸馏液的驱避活性虽小，但可以通过添加不同种类的有效单一组分进行优化，得到高效无醇花露水。

图 2 板栗花蒸馏液及精油有效成分的有效驱蚊时间 Figure 2 The effective repellent time of distillate and active components of essential oil from chestnut flower

图选项

采用正交实验，通过向每100 ml板栗花蒸馏液中补充4种强效驱蚊组分，得到驱蚊花露水的最优配比。表 3是正交实验方案表，表 4是正交实验结果。

表 3 L₉（3⁴）正交实验因素水平表 Table 3 Factors and levels of L₉(3⁴) orthogonal.

表选项

表 4 正交实验结果 Table 4 Results of orthogonal experiment.

表选项

由表 4的极差分析可知，影响驱蚊时间的因素顺序依次为B＞A＞D＞C，即香叶醇＞薄荷醇＞松油醇＞芳樟醇。直观分析得到花露水复合精油最佳配比条件为A₂B₂C₃D₁，即以板栗花蒸馏液为基准，每100 ml蒸馏液中加入薄荷醇1 g，香叶醇1.5 ml，芳樟醇0.25 ml，松油醇0.25 ml，此时驱蚊时间最长。按照上述最佳配比得到的无醇花露水，其有效驱蚊时间为2.50 h，市售花露水为2.25 h，驱蚊效果优于市售隆力奇驱蚊花露水。 3　讨　论

蚊虫叮咬不仅能引起人体局部皮肤红肿，而且有可能导致全身系统性的过敏反应^[7]，同时也是多种传染性疾病，如疟疾、登革热、流行性乙型脑炎等疾病的主要传播媒介。因此，驱蚊及灭蚊是预防或减少这些疾病的有效途径。目前广泛使用的驱蚊剂DEET，最初是作为农场杀虫剂使用的，其结构是N，N-二乙基-3-甲基苯甲酰胺，现代研究显示它的作用机制是通过阻断昆虫嗅觉受体，使其失去对人类或动物发出特殊气味的感官达到驱蚊作用。但是，近年来有研究报道，其对中枢神经系统中的乙酰胆碱酯酶活性有抑制作用，可导致人的失眠，心神不宁，因此，迫切需要筛选出高效低毒的杀虫剂。天然植物中，特别是一些植物精油，如丁香、柠檬、百里香等，对蚊虫具有明显驱避作用^[8]。然而，植物资源受到栽培时间、种植面积、季节等因素的限制，同时大多数精油是植物的次生代谢产物，精油的有效成分浓度太低，成为研究和开发具有使用价值的植物源驱避剂的瓶颈。板栗花不仅具有特有的清香，而且资源极其丰富，可为其深加工提供丰富廉价的原料。本实验通过对板栗花精油的驱避作用研究，发现其驱避有效时间高达3 h以上（表 2），并对其组成成分分析，得到12种活性物质，特别是单一组分芳樟醇、松油醇、香叶醇、薄荷醇的驱避有效时间达到3.75 h以上（图 2）。虽然近年来已经有多人报道植物精油具有驱避活性，如付臣臣等^[9]曾经证明薄荷油等植物精油对蚊虫具有强效驱避活性，Trongtokit等^[10]从丁香（Syzygium aromaticum）和柠檬（Citrus limon）中提取的精油做了蚊虫驱避实验，发现在实验室和现场实验中对按蚊、伊蚊和库蚊均有显著的驱避效果。Kanulanen等^[11]对从百里香精油中提取的芳樟醇、a-松油烯等对库蚊进行驱蚊实验，证明其具有比DEET更好的驱蚊作用。另外还有唇形科植物石香薷（Mosla chinensis）、广藿香（Pogostemon cablin）、迷迭香（Rosmarinus officinalis）对白纹伊蚊均具有较好的驱避活性；石香薷、广藿香以及芸香科（Rutaceae）、伞形科（Umbelliferae）等植物精油，对白纹伊蚊或淡色库蚊（Culex pipiens pallens）幼虫均表现出一定的毒杀活性^{[12, 13]}。然而将这些植物材料开发成植物源蚊虫驱避剂所面临的最大障碍是资源不足，不能满足工业化生产的需要。本实验结果表明，经过修饰后的板栗花花露水有效驱避时间大于市售驱蚊花露水，显示出其潜在的应用价值。对板栗花精油有效成分进行性状改良，如将精油制成微乳液，可以大大延长有效驱避时间，因而，板栗花精油有望开发成为高效、低毒的植物源蚊虫驱避制品，这对缓解目前化学灭蚊剂所面临的抗药性和生态环境方面的双重压力具有重要意义^{[14, 15, 16]}。