河北省坝上是河北省北部高原区的通称，包括张家口市的沽源、张北、康宝3县全部和尚义县以及承德市的丰宁、围场3县部分地区^[1]。啮齿动物种类繁多，长爪沙鼠（Meriones unguiculatus）和达乌尔黄鼠（Spermophilus dauricus）为主要宿主动物^[2]。夜行鼠通常是指夜间活动为主的一些小型啮齿动物。在鼠疫疫区，这些夜行鼠往往参与动物鼠疫的流行过程，有些还是鼠疫菌的储存宿主或高抗指示动物，在流行间歇期起到保存鼠疫菌的作用^[3]。所以，对坝上地区夜行鼠的鉴定有重要意义。

DNA条形码技术是通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分析而对物种快速鉴定的技术^[4,5]。该技术对于非成熟期、形态特征破损或残缺物种，濒危珍稀动物的无创伤鉴别以及区分近缘种和隐存种等都具备绝对优势。其中线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）最适合作为目标基因，用于动物分类鉴定中^[6]。 1　材料与方法 1.1　材料来源

　选用河北省坝上地区鼠类作为研究对象，分别取肝脏或肌肉保存于无水乙醇中，编号并保存整只鼠体（表 1）。

表 1 实验样本信息 Table 1 Information on the experimental samples

表选项

　制作剥制标本，观察外部和头骨形态，并测量相关数据，通过检索表鉴定^[7]。 1.3　试剂

　基因组提取试剂盒为Qiagen公司提供；dNTPs、LATaq DNA聚合酶等购自大连宝生物工程公司；通用引物为BatL 5310（5′-CCT ACT CRG CCA TTT TAC CTA TG-3′）和R6036R（5′-ATC TCT GGG TGT CCA AAG AAT CA-3′），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 1.4　方法 1.4.1　模板DNA提取

　使用Qiagen试剂盒，按照说明书提取肝脏DNA或肌肉DNA，4 ℃保存，备用。 1.4.2　PCR扩增与测序

　PCR 反应扩增体系：10×缓冲液2.5 μl，dNTP 0.5 μl，引物各0.5 μl，LA Taq聚合酶0.15 μl，模板DNA 1 μl，ddH2O 19.85 μl。PCR 反应条件： 95 ℃预变性5 min，95 ℃变性45 s，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 个循环，最后再72 ℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，送北京擎科新业生物技术有限公司进行双向测序。 2　结　果 2.1　COⅠ基因扩增

　36份样本利用通用引物全部成功扩增出700～800 bp的片段，与目标片段（COⅠ基因片段）的长度相符，并经双向测序进一步确认。 2.2　同源性比对

　将测序获得的序列与GenBank中其他鼠类物种的DNA条形码进行Blast 比对，采集的小毛足鼠（Phodopus roborovskii）COⅠ序列与已知小毛足鼠（JX962163）同源性为100%；子午沙鼠（Meriones meridianus）COⅠ序列与已知子午沙鼠（KC193077）同源性为99%；采集的五趾跳鼠（Allactaga sibirica）COⅠ序列与已知五趾跳鼠（JF499181）同源性为99%；采集的黑线仓鼠（Cricetulus griseus）COⅠ序列与已知黑线仓鼠（HM102296）同源性为100%；采集的小毛足鼠（HBK002、HBK012）和黑线毛足鼠（Phodopus songorus）（HBK017、HBK024、HBK033）COⅠ序列与已知蒙古毛足鼠（Phodopus campbelii）（KC017833）同源性为100%；黑线仓鼠（HBG037、HBG046）COⅠ序列与已知洮州绒鼠（Eothenomys eva）（HM165281）同源性为84%。 2.3　样本的分子进化树

　利用Mega 5.0软件分析不同个体间的遗传距离，各鼠种内遗传距离分别是：小毛足鼠0～0.004%，蒙古毛足鼠0～0.018%，子午沙鼠0～0.009%，五趾跳鼠0.007～0.022%，黑线仓鼠0～0.020%，洮州绒鼠0～0.216%。同时应用邻接法（Neighbor-Joining meT_hod，NJ）构建分子进化树，自检值设为1000次（图 1）。

注：JX962163（小毛足鼠，中国）、KC017833（蒙古毛足鼠，中国）、KC193077（子午沙鼠，中国）、JF499181（五趾跳鼠，俄罗斯）、HM102296（黑线仓鼠，美国）、HM165281（洮州绒鼠，中国）为GenBank中所获得的已知鼠种；其余编号为河北省坝上地区采集样本。 图 1 根据COⅠ序列构建的分子进化树 Figure 1 Molecular evolutionary tree constructed based on COⅠsequences

图选项

根据构建的分子进化树与形态学鉴定结果比对，除HBK002、HBK012、HBK017、HBK024、HBK027、HBK033、HBG037、HBG046外，其余标本形态学鉴定和分子进化树显示的结果均一致。HBK027用传统形态学鉴定为黑线毛足鼠，HBK002、HBK012用传统形态学鉴定为小毛足鼠，HBK017、HBK024、HBK033用传统形态学鉴定为黑线毛足鼠。而分子进化树中，HBK027与黑线仓鼠聚集在一个分支，HBK002、HBK012、HBK017、HBK024、HBK033与蒙古毛足鼠聚集在一个分支，提示形态学鉴定可能有误。经反复比对形态标本、头骨，鉴定为蒙古毛足鼠，更正形态学鉴定。

HBG037、HBG046经比对未发现GenBank中有相似度较高的基因，与之相似度最高的HM165281为洮州绒鼠，仅有84%的基因相似度。文献显示河北省东北部地区有同属的岢岚绒鼠（Caryomys inez）的记录^[8]，由于该标本仅有的头骨损毁严重，不能依靠形态特征确定该标本的鼠种，有待进一步研究。

此次鉴定发现的蒙古毛足鼠原为黑线毛足鼠的亚种，Savronova等（1992）发现二者的染色体特征不同，认为它们为不同物种。Musser和Carleton（1993）、Parlinov等（1995）、王应祥等（2002）和Wilson等（2005）也均将蒙古毛足鼠视为独立种^[7]。

从进化树可见，同属和同种鼠类均能够被明确的分入相应分支。说明DNA条形码COⅠ基因能够用于鼠类的分类鉴定，而且在鼠体不完整的情况下进行鼠种鉴定拥有绝对优势。DNA条形码与传统物种鉴定方法相比具有三大优势：首先，技术的简便性，简捷快速，易于构建统一的DNA条形编码数据库；其次，鉴定的准确性，可以实现门、纲、目、科、属、种、亚种等不同分类水平物种的鉴定，且具有高度的可重复性；第三是使用方便，研究者可以利用DNA条形编码数据库方便地进行数据对比，完成鉴定工作。而且DNA条形码在研究生物多样性和发现新物种方面具有独特的优势^[9]。

对宿主动物鉴定，传统的形态学鉴定是基于对外形、头骨、牙齿等特征的仔细观察并且十分依赖和模式标本的对比，专业性极强，然而大部分野外工作者并不具备足够的专业知识^[10]。DNA条形码不仅是传统物种鉴定的强有力补充，更由于它采用数字化形式，使样本鉴定过程能够实现自动化和标准化，突破了对经验的过度依赖，并可利用有机体的残片进行快速有效的鉴定，能够在较短时间内建立形成易于利用的应用系统，在生命科学、法医学、流行病学、疾病诊治、生态等社会、经济领域具有广泛的应用前景，也给经济动植物的品种保护和鉴别提供了新的手段，给全球物种分类研究和濒危动物、植物保护等科学领域开辟了一个新的思路。国内对这项技术的应用处于起步阶段，相关的研究也仅限于对一些物种分类的个例。今后，我们应该充分利用国内丰富的动植物资源，大力推动DNA条形码技术在生物演化、进化趋势、物种演变、分类学等领域的深入研究，促进DNA条形码技术在食品安全、为野生动物的保护提供司法依据以及发展畜牧业和养殖业等行业的广泛应用，为搭建DNA分类的国际平台贡献自已的力量^[11]。