登革热（dengue fever，DF）是由1～4型登革热病毒（Dengue virus，DV）引起的重要虫媒传染病，流行于热带和亚热带的100多个国家及地区，已成为日益严重的全球性公共卫生问题。2013年登革热被列为全球最重要的蚊虫传播性疾病，据WHO统计，近50年登革热的发病率较以前增加了30倍，全球约有25亿人群的健康受到DV感染的威胁，每年约有5000万新增感染病例^[1]。2013年由于气候温暖，水量充沛，媒介蚊虫大量孳生，使得全球登革热疫情明显上升^{[2, 3]}。登革热在东南亚、太平洋岛国及加勒比海地区流行频繁，其中与我国接壤的东南亚国家最为严重^{[4, 5]}，使得我国输入性病例的发生、传播概率大为增加^{[6, 7]}。浙江省曾在2004年和2009年分别由输入性病例引起慈溪和义乌市登革热暴发疫情^{[8, 9]}，2013年由于受全球登革热疫情的影响，浙江省报告疑似输入性登革热病例38例，比2012年（9例）上升了3.2倍，为了对这些疑似病例及时作出实验室确诊并掌握病原的分子特征，以便采取有效的防控措施，本研究对患者样本进行了实验室诊断和病原的分子溯源。 1　材料与方法 1.1　病例和标本

病例资料来源于中国疾病预防控制中心（CDC）传染病报告信息管理系统。2013年浙江省报告登革热实验室诊断病例38例，输入国主要是菲律宾（8例）、安哥拉（7例），其次是印度、泰国、柬埔寨、斯里兰卡、巴西和缅甸；发病高峰期在6-10月，占总病例数的71.0%（27/38）；男女性别比为1.71∶1，年龄在3～70岁，其中20～39岁占63.2％（24/38），病例主要是涉外经商服务、旅游和探亲者；38例患者中除1例印度籍外其余均为浙江省人。本实验室共收到市、县级CDC送检的18例患者血清，样本带冰运送至实验室，-80 ℃低温冰箱保存。38例登革热患者中，20例实验室诊断工作由浙江省市、县级CDC完成。 1.2　抗体测定

DV IgM抗体测定采用捕获酶联免疫试验，试剂购自澳大利亚Panbio有限公司，实验操作和结果判断均按试剂盒说明书进行。 1.3　核酸检测

病毒核酸提取采用德国QIAGEN公司的RNeasy mini Kit，按试剂盒说明书进行。具体取血清标本200 μl或细胞阳性分离物100 μl，最终洗脱至50 μl，作为RNA模板。核酸检测采用DV通用和DV型特异性荧光RT-PCR方法，引物序列和实验方法参照中华人民共和国卫生行业标准——登革热诊断标准（WS 216-2008）中附录A——登革热病原学检测方法进行。 1.4　病毒分离

患者血清接种C6/36细胞（来源于中国CDC病毒病预防控制所脑炎室），置28 ℃ 5％CO2孵箱培养，以出现细胞病变（CPE），或细胞培养上清液经DV特异性荧光RT-PCR方法检测到病毒核酸者为阳性。 1.5　RT-PCR扩增E基因

DV-1引物自行设计，F1：CAA GAA CCG AAA CRT GGA TGT C，R1：GGC TGA TCG AAT TCC ACA CAC，扩增片段为1849碱基（bp）；DV-4引物见参考文献^[10]。试剂采用宝生物工程（大连）有限公司one Step RNA PCR Kit（Code No：DRR024A），按试剂盒说明书进行。反应条件：42 ℃ 30 min反转录，94 ℃ 2 min后，94 ℃ 30 s、51 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min，循环40次，72 ℃ 延伸8 min。取扩增产物5 μl，用1.5％琼脂糖凝胶电泳，根据Marker位置确认反应产物。 1.6　序列测定和分析

采用PCR扩增产物纯化后直接测序，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。数据处理采用Dnaman和ClustalX 软件，进化树的构建采用Mega 6.0软件，建树方法采用邻位连接法（neighbor-joining，NJ），可信度评估采用1000 bootstrap值。 1.7　测序数据递交基因库

7株DV E基因测序数据已递交GenBank，登录号为KJ415092～KJ415098。 2　结　果 2.1　抗体和核酸检测

对18份血清样本同时进行DV IgM抗体和核酸检测，结果IgM抗体阳性15份，阳性率为83.3％；病毒核酸阳性8份，阳性率为44.4％。18份血清样本在发病后≤5 d内采集8份，占44.4％；＞5 d采集10份，占55.6％，由于样本在发病后采集的时间不同，其抗体、核酸和病毒检出率不一样，表 1为7例病毒分离阳性患者的信息和实验室检测结果，其余11例疑似患者DV IgM抗体均阳性，病毒分离均阴性，核酸阳性1例。

表 1 2013年浙江省部分登革热病例背景信息及检测结果 Table 1 Demographic information of dengue fever patients and the test results in Zhejiang province,2013

注： “-”表示检测结果为阴性； “＋”表示为阳性。

表选项

18份样本接种C6/36细胞后，7份样本出现CPE，特征为细胞变圆、集聚和融合，当CPE达到75%～100%时收获。未出现CPE的样本继续盲传3代，对所有分离物上清液检测DV核酸，阳性7份，18份标本中分离到7株病毒（38.9％）。对7株DV扩增病毒E基因，测序数据经GenBank Blast程序比对，其中6株为DV-1，1株为DV-4，从分子水平进一步证实病原为DV（表 1）。 2.3　同源性分析

新分离7株DV E基因全长均为1485个核苷酸（nt），推导编码495个氨基酸（aa），6株DV-1株之间nt和aa同源性分别为90.9％～99.7％和96.8％～100％，与浙江省2004年DV-1株之间nt和aa同源性分别为91.4％～98.5％和96.6％～99.0％（表 2）；2013年浙江省7株DV与相同血清型DV原型株之间的nt和aa同源性分别为92.4％～99.8％和96.6％～99.4％，而与不同血清型DV原型株之间nt和aa同源性分别为63.4％～69.4％和62.7％～68.6％。

表 2 2013年浙江省登革热分离株E基因核苷酸和氨基酸同源性比较 Table 2 Homologous comparison of the nucleotide and amino acid sequences of the E gene in dengue viruses isolated in Zhejiang province,2013

注：表中右上三角为核苷酸同源性； 左下三角为氨基酸同源性。

表选项

将登革热分离株E基因序列与GenBank下载的不同国家、不同年份、不同基因亚型的毒株序列构建进化树，由图 1可见，DV分为4个血清型，本次分离的7株病毒分别位于DV-1和DV-4分支上；DV-1又分成5个基因亚型GⅠ～GⅤ，本次分离的6株DV-1分别位于GⅠ、GⅣ和GⅤ亚型上，而与2004年引起浙江省慈溪市登革热暴发疫情的DV-1分离株Zhejiang/07/04未紧密地集聚在一起；进化树将DV-4分成3个基因亚型GⅠ～GⅢ，本次分离的DV-4株ZJ/02/13位于GⅠ亚型上（图 2），与日本D4/73NIID株亲缘关系最近，与国内广州DV-4株LD34-GZ1990进化关系稍远。

注：浙江省DV分离株E基因核苷酸序列（1485 nt）与GenBank下载的DV毒株序列采用NJ法构建进化树，boostrap值取1000； ●为2013年浙江分离株； ◆为2004年和2009年浙江省登革热暴发疫情分离株； 毒株命名：省份（ZJ）/标本编号/分离年份； 下载序列：毒株名称/GenBank accession number。 图 1 2013年浙江省DV分离株E基因进化分析 Figure 1 Phylogenetic analysis of the E gene in the dengue virus strains isolated in Zhejiang province,2013

图选项

注：浙江省登革热4型株E基因核苷酸序列（1485 nt）与GenBank下载的DV毒株序列采用NJ法构建进化树，boostrap值取1000； ●为浙江分离株，毒株命名：省份（ZJ）/标本编号/分离年份； 下载序列：毒株名称/GenBank accession number。 图 2 2013年浙江省登革热4型E基因进化分析 Figure 2 Phylogenetic analysis of the E gene in the DV-4 strain isolated in Zhejiang province,2013

图选项

疑似登革热病例早期实验室诊断，对于及时采取针对性防控措施非常重要，因此，对疑似病例应尽早采集样本进行确诊，由于样本在发病后采集的时间不同，其抗体、核酸和病毒的检出率不一样。本研究对18份样本（采集于发病后1～12 d）检测DV IgM抗体，结果15份阳性，3份阴性，该3份样本采集于发病3 d内，但DV核酸阳性；发病≤5 d内采集的样本共8份，其中7份病毒分离阳性，＞5 d采集的样本核酸和病毒检出率较低，因此，当临床上对疑似登革热患者进行实验室诊断时，必须考虑样本采集的发病时间不同选择合适的检测方法，尤其是发病3 d内采集的样本当登革热IgM抗体阴性而临床症状典型又具有流行病学史时，需考虑做核酸检测，防止漏检，以便早期诊断。

根据抗原性不同DV可分为1～4型 4个血清型（Serotype），依据病毒E基因不同又可以分成不同基因亚型（Genotype），不同的地理区域流行着不同的血清型和基因型^[11]，因此对病毒进行分子特征研究，可以从分子水平进行溯源。由于DV包膜糖蛋白由E基因所编码，位于病毒毒粒表面，构成毒粒的突起，是主要结构蛋白，决定着DV的组织亲嗜性，介导病毒与细胞受体的结合，可诱导特异性的保护性中和抗体^[12]，因此，E基因是分析DV基因亚型、病毒变异与进化的最佳区域。

采用DV E基因全长序列构建进化树，结果显示，DV-1分成亚洲型、泰国型、森林/马来西亚型、南太平洋型和美洲/非洲型5个基因亚型，本次浙江省新分离6株DV-1分别位于3个基因亚型上，其中ZJ/11/13株属于亚洲型，病例为斯里兰卡输入；ZJ/01/13株、ZJ/08/13株和ZJ/12/13株属于南太平洋型，病例为菲律宾和安哥拉输入；ZJ/03/13和ZJ/04/13株属于美洲/非洲型，病例为印度和缅甸输入；这6株DV-1与浙江省2004年、2009年登革热暴发疫情分离株（Zhejiang/07/04、ZJ/17/2009）亲缘关系较远，说明2013年浙江省新分离的DV-1与2004年、2009年浙江DV分离株为不同来源的毒株。进化树将DV-4分成东南亚型、印度尼西亚型、泰国型和森林/马来西亚型4个基因亚型，本次浙江省DV-4株（ZJ/02/13）属于东南亚型，与浙江株亲缘关系最近的毒株为日本D4/73NIID株，而与国内广州株LD34-GZ1990则亲缘关系相对较远。本次DV-4为本省首次分离，该毒株分离于发病前曾到过巴西的患者样本；进化分析说明，2013年浙江省登革热分离株均为输入性，输入的地区有非洲、美洲和东南亚等，DV的来源广泛，涉及的基因亚型种类多，DV-1除了早期的森林/马来西亚型和泰国型以外，目前在全球各地流行的其他3个基因亚型均有输入。

浙江省虽然不属于登革热地方性流行区，但部分地区具备登革热传播的媒介蚊虫和环境条件，存在由输入病例引起本地登革热暴发疫情的风险，如2004年慈溪市登革热1型暴发疫情，导致113例发病^[8]，2009年义乌市登革热3型暴发疫情，导致180例发病^[9]，这些事件为我们敲响了警钟，2013年浙江省输入性登革热病例虽然比以往明显增加，但由于对疑似病例及时作出实验室确诊，并采取有效的登革热防控措施，因此未发生由输入病例引起的本地登革热暴发疫情。