中国媒介生物学及控制杂志  2014, Vol. 25 Issue (6): 591-593

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邱星辉
QIU Xing-hui
细胞色素P450在家蝇抗药性中的作用
Roles of cytochrome P450s in insecticide resistance in the house fly, Musca domestica
中国媒介生物学及控制杂志, 2014, 25(6): 591-593
Chin J Vector Biol & Control, 2014, 25(6): 591-593
10.11853/j.issn.1003.4692.2014.06.032

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收稿日期:2014-07-21
细胞色素P450在家蝇抗药性中的作用
邱星辉    
中国科学院动物研究所, 农业虫害鼠害综合治理研究国家重点实验室, 北京 100080
摘要:细胞色素P450是几乎存在于所有生物体中的一类重要的酶,已知在昆虫对杀虫剂的代谢解毒过程中发挥着非常重要的作用。细胞色素P450对杀虫剂解毒作用的增强是导致昆虫对杀虫剂产生抗药性的普遍而重要的机制。该文综述了有关家蝇细胞色素P450研究的一些重要进展,着重介绍家蝇抗药性相关的细胞色素P450以及细胞色素P450在一些相对新的杀虫剂抗性中的作用。
关键词细胞色素P450     家蝇     杀虫剂抗性    
Roles of cytochrome P450s in insecticide resistance in the house fly, Musca domestica
QIU Xing-hui     
State Key Laboratory of Integrated Management of Pest Insects and Rodents, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080, China
Abstract:Insect cytochrome P450s are well known to play an important role in the process of insecticide detoxification. Enhanced detoxification of insecticides is a common mechanism responsible for the development of resistance to various insecticides in insects. This article introduces the current advances in the study of insecticide resistance-associated cytochrome P450s and the potential involvement of cytochrome P450s in the resistance to relatively new insecticides in the house fly (Musca domestica).
Key words: Cytochrome P450     Musca domestica     Insecticide resistance    

家蝇(Musca domestica)是一种重要的疾病传媒,不仅危害人类健康,还能降低蛋奶产量而影响畜牧业生产[1]。随着化学农药的大量使用,家蝇普遍产生了抗药性[2],家蝇的抗药性成为家蝇防治工作中的一大障碍。以往研究结果表明,昆虫抗药性的主要机制包括杀虫剂靶标的不敏感性(靶标抗性)和杀虫剂代谢作用增强(代谢抗性)[3]。代谢抗性通常是由昆虫中的解毒酶系对杀虫剂的解毒作用导致,其中细胞色素P450酶系作为Ⅰ相代谢酶,在杀虫剂的代谢解毒中发挥着重要作用[3]。细胞色素P450是一类蛋白超家族,在昆虫中表现出种类的多样性,这类酶常被昆虫用于应对杀虫剂的选择压。现就家蝇抗药性相关的细胞色素P450以及细胞色素P450在一些相对新的杀虫剂抗性中的作用做一综述。 1 家蝇细胞色素P450与有机磷杀虫剂抗性

  在多重抗性的家蝇Rutgers 品系中检测出CYP6A1的过量表达[4],该P450被推测与二嗪磷抗性有关。对15个家蝇品系的进一步调查发现,CYP6A1只在8个抗性品系中存在不同程度的过量表达[5],而在其他7个抗性品系中的表达量与敏感品系差异不显著,这一结果反映了二嗪磷抗性的种群特异性和抗性机制的复杂性。遗传学研究结果表明CYP6A1位于家蝇的5号染色体上,在抗性品系的幼虫和成虫都表现出组成性过量表达,且受位于2号染色体半显性因子的控制。CYP6A1基因的拷贝数在敏感和抗性品系中相同(Rutgers和标准的敏感品系sbo比较),因此CYP6A1的过量表达不是基因扩增的结果;2个品系CYP6A1编码的氨基酸序列完全一致,提示在Rutgers品系二嗪磷抗性是其CYP6A1酶量增加,而不是结构基因突变的结果[6]。在大肠埃希菌中表达的CYP6A1重组蛋白和NADPH-细胞色素P450还原酶组成的酶系具有代谢二嗪磷的活性(18.7 pmol/pmol CYP6A1/min)[7]。这些数据充分表明CYP6A1的过量表达导致了某些家蝇品系对二嗪磷产生抗性。

CYP12A1编码家蝇线粒体P450,该基因在家蝇Rutgers品系中也过量表达。在大肠埃希菌中异体表达的CYP12A1蛋白与电子供体(牛线粒体蛋白皮质铁氧还蛋白和皮质铁氧还蛋白还原酶)重组后可以代谢许多不同的杀虫剂(如艾氏剂、七氯、二嗪磷)以及其他一些外源性化合物,而不能代谢蜕皮甾体、保幼激素类似物(juvenoids)或脂肪酸。CYP12A1在抗性品系中过量表达且具有代谢杀虫剂的能力,说明该线粒体P450可能在家蝇抗药性、特别是在对有机磷化合物抗药性中发挥作用[8]2 家蝇细胞色素P450与拟除虫菊酯类杀虫剂抗性

  拟除虫菊酯类杀虫剂被广泛用于防治害虫,特别是双翅目昆虫[9]。由于拟除虫菊酯类农药的大量使用,世界各地的家蝇种群均表现出对拟除虫菊酯类杀虫剂较高水平的抗性。

有关拟除虫菊酯类杀虫剂抗性的机制,美国康奈尔大学Scott教授实验室的研究人员以LPR抗性家蝇(多抗性品系)开展了持久的、系统的工作。生物测定、生物化学、遗传学和分子生物学等多方面的研究结果显示,定位在常染色体1上的CYP6D1是LPR品系家蝇对拟除虫菊酯类农药抗性相关的细胞色素P450,抗药性是由于CYP6D1蛋白超量导致,而CYP6D1超量表达是CYP6D1基因转录水平增高而非其mRNA稳定性增强的结果。CYP6D1抗性等位基因(命名为CYP6D1v1),具有2个独特的序列特征,其一是开放读框(ORF)编码的蛋白与敏感品系存在不同的5个氨基酸(Asp150Ala、Ile153Leu、Thr165Ser、Glu218Gln、 Met227Ile),另一个显著的不同是该基因的5′-侧翼区仅在LPR中存在1个15 bp的插入片段,该15 bp的插入片段被认为在CYP6D1的转录增强中起作用[10]。类似地,NG98品系家蝇对氯菊酯具有很高的抗性,其CYP6D1相对敏感品系来说表现为超量表达[11],NG98与 LPR品系家蝇的CYP6D1基因的开放读框及其5′-侧翼区的序列完全相同,表明这2个品系拥有相同的CYP6D1v1等位基因。CYP6D1v1介导的抗性演化可能发生在基因调控的不同层面上(如开放读框的改变、常染色体1转录因子的变化,常染色体2转录因子的变化等),其中15 bp插入和开放读框的改变可能是同时出现的[12]

YPER品系家蝇对氯菊酯的高抗性(抗性倍数>18 000倍)表现出多基因和不完全隐性特征,各染色体的相对贡献为:2>3>5>=1(数字为染色体编号)[13]。该品系家蝇抗性可被细胞色素P450抑制剂(PBO)降低,且其微粒体P450含量是敏感家蝇的3倍,说明P450在抗药性中发挥了重要作用。不同于NG98和LPR品系家蝇,YPER品系家蝇对氯菊酯抗性的主效基因位于染色体5,而不是CYP6D1[13]。YPER品系家蝇对氯菊酯高抗性的分子基础还未得到阐明。

Zhu和Liu[14]从拟除虫菊酯抗性品系ALHF家蝇中分离了2个细胞色素P450等位基因(CYP6A5CYP6A5v2),它们在氨基酸序列上有98%的相似性,其中CYP6A5v2在ALHF家蝇中组成性过量表达,主要在家蝇的解毒器官所在的腹部表达,但 CYP6A5在ALHF中的表达与敏感家蝇无差异。遗传连锁分析表明CYP6A5v2作图于常染色体5,其超量表达与杀虫剂抗性相关联,提示CYP6A5v2在 ALHF家蝇代谢解毒作用增强中的作用。CYP6A5CYP6A5v2在抗性与敏感品系中的表达不同预示这2个共存于同一生物体的相似基因存在功能差异。Zhu等[15]发现用氯菊酯处理ALHF品系家蝇,导致了3个P450基因(CYP4D4v2CYP4G2CYP6A38)共同上调表达,且这种诱导效应因药剂的剂量和作用时间不同而有所不同,由此推测这3个基因编码的蛋白序列在抗性 ALHF及敏感的aabys和CS间没有差异。CYP4D4v2CYP6A38位于染色体5,CYP4G2位于染色体 3。这项研究结果表明,抗性家蝇可以以诱导的机制共同提高多个细胞色素P450的表达,反映细胞色素P450在杀虫剂的解毒、对环境的适应中的功能重要性。另外,Zhu等[16]还从家蝇中分离了另外2个新的 P450 cDNAs,分别为CYP6A36CYP6A37,这2个基因在蛋白水平上有58%的相似性,其序列在抗性ALHF和敏感aabys家蝇中无差异。相对于敏感品系,CYP6A36在ALHF品系家蝇的腹部过量表达,而CYP6A37的表达量在品系间无差异。CYP6A36位于染色体5,其过量表达与染色体1和2的因子相关联,表明CYP6A36在ALHF家蝇中杀虫剂代谢解毒和抗性进化方面起重要作用。

Gao等[17]发现中国家蝇的野外种群普遍表现出对拟除虫菊酯杀虫剂的高水平抗性,细胞色素P450介导的代谢解毒作用是抗性的主要机制;抗性等位基因 CYP6D1v1在中国家蝇中普遍存在,且与美国家蝇种群中检测到的CYP6D1v1抗性等位基因具有单一的进化起源;同时发现,抗性家蝇普遍表现出多个P450基因的过量表达,推测除 CYP6D1v1外,CYP6G4可能是一个在中国家蝇拟除虫菊酯抗性中起作用的重要细胞色素P450,这一推测还需通过杀虫剂代谢实验来进一步验证。

从以上研究结果可以发现,家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性的遗传基础是非常复杂的,不同的家蝇种群,即使表现出相同的抗性表型,其中起作用的P450也可能不同。 3 家蝇细胞色素P450与其他类型杀虫剂抗性

随着昆虫抗药性的产生以及法律法规的限制,一些杀虫剂不能再使用,这就需要发展新的安全制剂来控制害虫。近年来一些相对新的杀虫剂开始用于家蝇的控制,细胞色素P450与这些杀虫剂抗性的相关性也得到一些证据的支持。但直至目前,这些杀虫剂抗性的分子基础还没有得到清楚的阐明。

氟虫腈(fipornil)为苯基吡唑类(phenylpyrazole)化合物,是一些重要农业昆虫的高效杀虫剂。研究表明多重抗性的家蝇LPR品系表现出对氟虫腈15倍抗性(LD50)[18],单加氧酶代谢解毒是产生氟虫腈抗性的机制之一[19]。以从田间采集的在实验室汰选的抗性达140倍的家蝇品系为材料的PBO增效实验也表明,细胞色素P450在氟虫腈抗性中起作用[20]

茚虫威(Indoxacarb)是一种氧二氮(杂)苯(oxadiazine)杀虫剂,对许多害虫有效。用茚虫威从田间采集的家蝇汰选出茚虫威抗性品系(NYINDR)抗性(>118倍)可以部分被PBO克服,表明 P450单加氧酶活性与茚虫威抗性相关。NYINDR品系家蝇对茚虫威的抗性主要以完全隐性而遗传,连锁分析发现,引起抗性的主要因子位于常染色体4,次要因子在常染色体3[21]

新烟碱类杀虫剂(如吡虫啉imidacloprid和噻虫嗪thiamethoxam)已被用于家蝇的控制。在丹麦的2个田间家蝇种群中检测到对该类杀虫剂的抗性。这类抗性可以被PBO所抑制,抗性种群家蝇表现出CYP6A1、CYP6D1CYP6D3的组成性过量表达,其表达量还可被该类杀虫剂所诱导。这些数据表明,细胞色素P450在新烟碱抗性中起作用,且抗药性与CYP6A1、CYP6D1CYP6D3过量表达相关联[22]。最近的一个研究表明,从佛罗里达(Florida)采集的经实验室汰选的吡虫啉高抗性品系,PBO处理并没有明显的增效作用,表明P450介导的代谢不是该品系抗性的原因[23]

多杀菌素(Spinosad)是从刺糖多胞菌(Saccharopolyspora spinosa)发酵液中提取的一种大环内酯类杀虫剂,已作为饵剂用于家蝇的控制。增效剂的增效实验表明,解毒酶类对多杀菌素的代谢解毒作用在NYSPINR和SPRR品系抗药性中的贡献不大[24, 25]。 PBO增效实验和CYP6A1、CYP6D1CYP6D3的表达水平分析提示细胞色素P450在家蝇对多杀菌素的抗性中起着一定作用[26]。  4 抗性相关细胞色素P450的分子检测方法

抗药性的检测用得最多的是生物测定法,即通过测定剂量与死亡率效应来计算种群的LD50或LC50值。生物测定法容易操作,对设备的要求低,适合未知抗性机制的抗性检测,但该方法的缺点是费时并且需要很多的试虫,更重要的是无法定量种群的抗性潜力和发展趋势。在家蝇抗药性分子基础得到阐明后,抗药性可以通过检测抗性相关的遗传变异(即分子检测方法)来实现。分子检测方法不仅具有快速、灵敏等特点,可用于抗性的早期预警以及用于测定田间抗性等位基因频率的动态,监测抗性的发展趋势。

细胞色素P450介导的抗药性往往是由于基因扩增或超量表达的结果,因此这类抗性的检测在原理上可以采用定量 PCR、分子杂交技术和基因芯片技术,但至今应用实例少有报道。CYP6D1v1等位基因的存在已被证明可以导致家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性,该等位基因序列特征的鉴定为建立该等位基因的检测方法提供了可能。CYP6D1v1的5′-非编码区含有一段15 bp的插入片段可以用于建立等位基因特异性PCR(AS?PCR)的检测方法[27];该15 bp插入片段还打断了一个酶切位点,基于这一特征的PCR-RFLP检测方法,也已被开发出来[28]5 结语   P450介导的杀虫剂代谢抗性呈现出普遍性和进化可塑性的特点,其中的分子机制很复杂。P450介导抗性的普遍性及进化可塑性的分子基础是家蝇P450的种类多样性和P450底物的重叠性。尽管P450在家蝇抗药性中的重要性为大家所熟知和认可,但从生物化学和分子水平上得到根本证据的仅有CYP6A1、CYP6D1CYP12A1。随着家蝇基因组的诠释,对各类杀虫剂抗性的细胞色素P450将会更快地得到鉴定。有关家蝇抗药性机制的阐明,可以为抗性的检测和监测提供比传统生物测定方法更方便和快捷的手段。有关抗性机制和杀虫剂作用方式的知识可以用于预测交互抗性的可能性,为家蝇的有效控制提供科学依据。

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