近年来，鼠类随国际航行交通工具在世界范围内迁移速度和频率有增加趋势^[1]，尤其是一些远洋货轮船龄长、航程远，停泊过上百个国家和港口，同一艘船上可能存在2种鼠甚至同种鼠多亚种共生情况，仅依靠外形鉴定是否为输入性或不同亚种存在较大困难或争议。

　　随机扩增多态DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）技术通过选择合适引物，用少量未知基因核苷酸序列模板DNA即能把基因间差异显示出来，从而获得DNA多态性图谱^[2]，且成本低、结论快，不需要知道被检生物遗传背景，适合于口岸鼠类监测技术支撑。 1 材料与方法 1.1 材料

江苏口岸捕获本土褐家鼠（Rattus norvegicus）34只；远洋货轮输入性鼠8只。 1.1.2　主要试剂

琼脂糖（麦琪公司）、蛋白酶K（Merck公司）、核酸染料GOLDVIEW、MgCl₂ （25 mmol/L）（上海赛百盛基因技术有限公司）、dNTP Mixture、Taq DNA聚合酶（5 U/μl）及DNA Markers等〔宝生物工程（大连）有限公司〕。 1.1.3 实验引物

　购自生工生物工程（上海）有限公司，RAPD扩增随机引物为10 bp寡聚脱氧核苷酸，纯度HPLC级。 1.1.4　主要仪器

BG-Power600i电泳仪、Eppendorf PCR扩增仪及GIS-2008紫外凝胶成像系统。 1.2　DNA制备

　取鼠尾组织约1.5 cm，置于eppendorf管中，加入500 μl消化液（10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L EDTA，0.15% SDS，20 μg/ml RNase，100 μg/ml蛋白酶K），混匀后置56 ℃电热恒温水槽过夜至完全消化，期间上下颠倒混匀数次。消化后液体，离心半径16 cm，8000 r/min离心4 min，取500 μl上清液于第2支eppendorf管中，再加入300 μl苯酚、300 μl氯仿于该管中，颠倒混匀后，离心半径10 cm，13 000 r/min离心4 min，小心吸取200 μl上清液于第3支eppendorf管中，然后在该管中加入2倍体积无水乙醇，上下轻轻颠倒混匀后，离心半径10 cm，13 000 r/min离心10 min，弃上清，加入500 μl 75%乙醇洗涤沉淀，弃上清，室温晾干后加入100 μl灭菌双蒸水溶解，置-20 ℃冰箱备用。 1.3　RAPD扩增

　RAPD反应体积为25 μl，其中含2.5 μl 10×PCR buffer，1 μl MgCl₂（25 mmol/L），2.5 μl dNTP Mixture（2.5 mmol/L），2 μl Primer（25 μmol/L），0.5 μl Taq DNA聚合酶（5 U/μl），1 μl 基因组DNA，15.5 μl ddH₂O。扩增程序：94 ℃预变性3 min后进入循环，94 ℃变性45 s，37 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，35个循环，最后1个循环后于72 ℃延伸10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶（含核酸染料）电泳，紫外凝胶成像系统观察成像。 1.4　遗传距离分析

　对扩增结果进行统计，根据Nei和Li^[3]的相似系数公式F＝2Nxy/（Nx＋Ny），计算出RAPD片段的遗传相似指数F（也称共享度）和不同品系间的平均遗传距离指数P＝（1～F）。其中>Nxy是X、Y两个个体共有的扩增带，Nx、Ny是X和Y个体分别拥有的扩增带。根据遗传距离对检测样品的关系进行聚类分析，绘出聚类图。 2　结果 2.1　RAPD引物筛选结果

　以江苏口岸褐家鼠基因组DNA为模板，用120条引物首先扩增，随机选取20条引物再扩增，共扩增出108条带，每个引物平均扩增5.4条。结合PCR产物电泳条带大小、数目和清晰度，确定引物2、3、4和8为多态性良好的RAPD扩增引物，分别定名为P1（5′-TCG GCG GTT C-3′）、P2（5′-GAG AGC CGT C-3′）、P3（5′-ATG GCA TCT C-3′）和P4（5′-CTT GGC ACG A-3′），扩增结果见图 1。

图 1 20条随机RAPD-PCR引物筛选电泳结果

图选项

　以P1、P2、P3和P4为引物，对江苏口岸褐家鼠进行遗传距离分析。经35个循环后，将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳、染色和拍照，结果发现4条引物中3号引物P3多态性最强，条带最清晰，因此将P3引物重复3次，重复性较好。扩增条带片段大小在250～2000 bp之间，比较清晰的DNA条带数为5～15条（图 2），以强带的差异来区分褐家鼠遗传多态性。

图 2 江苏口岸褐家鼠RAPD扩增结果

图选项

　用NJ聚类法构建江苏口岸不同褐家鼠种群RAPD标记聚类图（图 3），可以看出长江南北口岸褐家鼠个体之间关系有一定距离。

图 3 不同褐家鼠种群RAPD标记聚类结果

图选项

　图 4显示，输入性褐家鼠来源复杂，遗传背景差距较大，种群间具有较高遗传多态性，可能属于多个亚种：首先3艘外轮上的褐家鼠与江苏口岸褐家鼠基因有较大差异，其次3艘外轮上的褐家鼠之间基因有差异，同一艘外轮上的褐家鼠基因也有差异，如印度籍外轮捕获的3、4号鼠之间DNA片段有较大差异；与1、2号比较，3号鼠在750、1700 bp处多1个条带，4号鼠在1800 bp处多1个条带。从同一艘马来西亚籍外轮捕获的5～7号鼠之间DNA片段也有明显差异；与1、2号比较，5号鼠在2000 bp处多1个条带，6号鼠在250 bp处多1个条带，7号鼠在500 bp处多1个条带。8～10号褐家鼠捕自同一艘俄罗斯籍外轮，这3只鼠遗传背景相似，属同一个亚种；与1、2号比较，在1900、1800和250 bp处多3个条带。

图 4 输入性褐家鼠RAPD扩增结果

图选项

　　研究发现，对外开放口岸（主要是海港）30～50 km范围内存在境外输入性鼠类与本土鼠类的杂交带^[4]，基因流有不同程度DNA混合，如发生遗传变异将影响口岸本土鼠传疾病的效能。

野生小鼠与近交系小鼠遗传距离分析中，李淑蓉等^[5]应用RAPD引物区分小鼠品系，雷建等^[6]对河南省地方野生小鼠与近交系小鼠进行了RAPD分析。本研究所有受试个体均为野生褐家鼠，不同受试个体之间基因DNA差异明显，测试样本为RAPD方法的可操作性和结果实用性提供了基础。本研究对口岸本土和输入性褐家鼠遗传背景以及遗传多态性方面差别分析，以个体DNA序列同源程度来判断遗传距离大小鉴别是否为输入性，对跟踪监测口岸范围内褐家鼠遗传变异，分析外来入侵种群对本土鼠种基因的影响以及预警鼠传疾病提供了科学依据。

　　由于输入性鼠和口岸本土鼠均是野鼠，与实验用鼠比较DNA序列同源程度较小，经RAPD扩增后遗传多态性丰富，甚至可能会出现怀疑最初形态学鉴别是否正确的情况，因此需要尽可能收集世界各地鼠类DNA资料，建立鼠类基因库。