鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）是严重自然疫源性疾病——鼠疫的病原菌，广泛分布于我国西北、西南等地区。我国鼠疫自然疫源地划分为12个型别^[1]。其中，锡林郭勒高原布氏田鼠（Lasiopodomys brandtii）鼠疫疫源地、青藏高原青海田鼠（Lasiopodomys fuscus）鼠疫疫源地的鼠疫菌具有独特的生化、遗传特征，毒力明显低于其他疫源地鼠疫菌，对人及大型哺乳动物不致病^[2]。近年来，已将这类田鼠来源的鼠疫菌定义为一个新的生物型——田鼠型（Microtus）鼠疫菌^[3]。除我国外，蒙古、中亚等地区也有田鼠型鼠疫菌流行^[2]，田鼠型鼠疫菌是由假结核耶尔森菌向鼠疫菌进化过程中的一个分支种群^[4]。

目前区分田鼠型与非田鼠型鼠疫菌主要依靠基于生化反应的生物分型方法^[3]，以及基于差异区段 （DFR）、可变数目串联重复序列（VNTR）、规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）等遗传标志多态性的分子分型方案^[2,5,6]。前者需要进行大量活菌操作，耗时长，结果不稳定；后者使用指标多，技术、分析复杂；限制了上述方法的使用。Bearden等^[7]发现，天冬氨酸酶（AspA）363位氨基酸是否发生错义突变可作为区分田鼠型与非田鼠型鼠疫菌的遗传标志。本研究以此为基础，拟建立一种简便的田鼠型与非田鼠型鼠疫菌聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分型方法（aspA?PCR-RFLP）。 1　材料与方法 1.1　实验菌株及核酸提取

　实验使用的鼠疫菌由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所鼠疫室保藏，包括田鼠型38株，非田鼠型55株（表 1）。菌株生物型均已经过细菌学、分子生物学确定。核酸提取：使用细菌基因组DNA提取试剂盒（DNeasy Blood & Tissue Kit，Qiagen公司产品）于生物安全三级实验室提取DNA，操作步骤参见说明书。DNA经无菌验证后置-20 ℃保存备用。 1.2　试剂与仪器

　Taq DNA 聚合酶、dNTP、DNA Marker等购自TaKaRa 公司；PCR引物由上海Sangon公司合成；Hpy CH4Ⅳ限制性内切酶购自New England Biolabs公司。DNA测序由北京擎科新业生物技术有限公司完成。序列分析及引物设计软件为DNAstar 6.0及Oligo 6.0。 1.3　天冬氨酸酶基因（aspA）酶切位点分析与引物设计

　用DNAstar软件分别预测田鼠型已测序菌株91001（AE017042）和非田鼠型已测序菌株CO92（AL590842）aspA基因序列的限制性酶切位点。根据预测： 91001aspA基因编码区1086～1089位含有Hpy CH4Ⅳ酶切位点（ACGT），而CO92由于aspA基因第1087位碱基发生突变（G/T）导致此酶切位点丢失。因此选择限制性内切酶Hpy CH4Ⅳ进行RFLP分析。根据Hpy CH4Ⅳ酶切位点位置确定PCR扩增引物AspA_F（5′-GGT AAT GCC ATT GAT GCA CTT CT-3′）和AspA_R（5′-CTC TTC TAT CAT GCC TGC AAA AGT-3′），扩增产物长度为227 bp。 1.4　aspA基因目的片段PCR扩增

　采用50 μl反应体系：10×缓冲液 5 μl；dNTPs （10 mmol/L）4 μl；引物AspA_F和AspA_R（20 mmol/L）各1 μl；Taq DNA 聚合酶（5 U/μl） 0.5 μl；模板1 μl；补足ddH2O至50 μl。反应条件：95 ℃ 预变性7 min，然后以94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，扩增30个循环，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃ 保存。PCR产物经电泳验证后采用PCR产物纯化试剂盒（Qiagen）纯化，4 ℃备用。 1.5　限制性片段长度多态性（RFLP）分析

　酶切反应（20 μl体系）：10×缓冲液2 μl，经纯化的PCR产物5 μl，Hpy CH4Ⅳ 1 μl，ddH2O 12 μl；反应管置于37 ℃水浴消化1 h。电泳：取5 μl消化产物，点样于2%琼脂糖凝胶，以5 V/cm的电场强度于0.5×TBE电泳缓冲液中电泳50 min，紫外凝胶成像并保存。 1.6 　aspA基因测序及序列比对

　aspA基因扩增产物纯化后，进行双向测序。双向序列通过DNAstar软件拼接，得到的完整序列利用Mega 5.0软件进行比对分析。 2　结　果

2.1　 aspA目的基因的PCR扩增

　引物AspA_F和AspA_R扩增93株不同来源、不同生物型的鼠疫菌aspA基因，均为阳性，产物长度约227 bp（图 1）。

图 1 部分鼠疫菌aspA基因PCR扩增结果 Figure 1 Electrophoretogram of PCR?amplified aspA fragments from selected Y. pestis strains of Microtus and non?Microtus biotypes

图选项

　用Hpy CH4Ⅳ酶切纯化的aspA扩增产物，可切出2种不同图谱：田鼠型鼠疫菌为126和101 bp两条带，为Ⅰ型；非田鼠型鼠疫菌为227 bp单一条带，为Ⅱ型。电泳结果见图 1、2，分型结果见表 1。

图 2 部分鼠疫菌aspA位点PCR扩增产物Hpy CH4Ⅳ 酶切电泳结果 Figure 2 Electrophoretogram of Hpy CH4Ⅳ?digested aspA fragments amplified from selected Y. pestis strains of Microtus and non?Microtus biotypes

图选项

表 1 实验所用菌株及其 PCR-RFLP分型结果 Table 1 PCR-RFLP typing of 93 Y. pestis strains of diverse origins and biotypes used in this study

表选项

　实验菌株的aspA基因序列保守，仅在第1087位碱基存在变异：田鼠型鼠疫菌为G，其他生物型菌株为T，结果见表 1。测序结果表明，此突变是导致Ⅰ型、Ⅱ型酶切图谱不同的原因。 3　讨　论

为适应不同的地理环境以及宿主，鼠疫菌在进化过程中出现了不同的基因型和表型。根据菌株毒力强弱、生化反应特征、宿主特异性等可将鼠疫菌区分为两大类：引起世界鼠疫大流行的流行株（epidemic isolates）和分布于中国、蒙古、前苏联等少数古老疫源地的非典型菌株（atypical isolates）^[2]。

很早已经发现，典型鼠疫菌（流行株）在低钙环境中生长停滞，同时伴有半胱氨酸（L?aspartic acid）在培养基中蓄积。这种现象被称为低钙反应（LCR），其原因是aspA基因发生单碱基错义突变，导致AspA酶失活，引起L-天门冬氨酸（L?aspartate）蓄积并影响三羧酸循环代谢。与此相反，Bearden等^[7]研究发现，田鼠型鼠疫菌的aspA基因为野生型，AspA酶并未失活。本研究中，我们建立了基于aspA单碱基多态性的田鼠型与非田鼠型鼠疫菌PCR-RFLP分型方法。各鼠疫疫源地代表菌株的PCR-RFLP以及aspA测序结果表明，该法可用于我国鼠疫疫源地两类菌株区分鉴别，并可作为判定菌株毒力的参考指标。值得注意的是，PCR-RFLP自四川省石渠县青海田鼠鼠疫疫源地的16株分离株中，区分出1株非田鼠型高毒鼠疫菌N14。PCR-RFLP以及aspA测序结果也说明，我国田鼠型鼠疫菌的aspA基因多态性相对简单，仅存在一种基因型。两个地理相隔遥远的田鼠型鼠疫疫源地具有相同的aspA基因型，提示其可能具有相同的起源，与Cui等^[5]根据CRISPR分析建立的我国田鼠型鼠疫菌迁移路径模型一致。

我国具有世界上面积最大、最具多样性的鼠疫自然疫源地；并且，近年来多个疫源地动物间鼠疫流行异常活跃，人间鼠疫时有发生。因此，对动物间鼠疫进行有效监测十分重要。本研究将PCR-RFLP应用于区分两类生物型的鼠疫菌，操作相对简单，具有较好的特异性，适合应用于鼠疫现场监测工作中。对于了解动物间鼠疫动态流行特征、明确界定田鼠型鼠疫菌疫源地范围、分析鼠疫对人类的威胁、防止鼠疫暴发流行等方面，将具有广泛的公共卫生学意义。