中国媒介生物学及控制杂志  2014, Vol. 25 Issue (5): 464-465

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胡群, 马思杰, 马研, 梅勇
HU Qun, MA Si-jie, MA Yan, MEI Yong
一例输入性板齿鼠的种类鉴定与分析
Species identification of an imported rodent sample of Bandicota indicaby morphological and genetic analysis
中国媒介生物学及控制杂志, 2014, 25(5): 464-465
Chines Journal of Vector Biology and Control, 2014, 25(5): 464-465
10.11853/j.issn.1003.4692.2014.05.022

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收稿日期:2014-08-12
一例输入性板齿鼠的种类鉴定与分析
胡群, 马思杰, 马研, 梅勇    
大榭出入境检验检疫局,浙江 宁波 315812
摘要目的 对1份从入境集装箱中检获的鼠样品进行种类鉴定。方法 运用形态学方法及DNA条形码技术进行鉴定分析。结果 鼠样品体长约252 mm,尾长220 mm,后足长40 mm,毛色呈黑褐色, cytB基因序列与板齿鼠同源性最为接近,与不同板齿鼠的遗传距离为0.048~0.175。结论 经形态鉴定和DNA条形码比对,确定为板齿鼠,系浙江省口岸首次检获该鼠种,为加强外来医学媒介生物防控提供了基础依据。
关键词板齿鼠     种类鉴定     线粒体细胞色素B基因     口岸    
Species identification of an imported rodent sample of Bandicota indicaby morphological and genetic analysis
HU Qun, MA Si-jie, MA Yan, MEI Yong    
Daxie Exit-Entry Inspection and Quarantine Bureau, Ningbo 315812, Zhejiang Provinca, China
Abstract:Objective  To identify the species of a rodent sample captured in an imported container at the port of Zhejiang province, China. Methods Morphological methods and DNA barcoding were applied for rodent identification. Results The rodent had dark-brown fur with an approximate body length of 252 mm, a tail length of 220 mm, and a hind foot length of 40 mm. Genetic analysis of the mitochondrial cytB gene showed that the rodent shared the highest sequence homology with Bandicota indica and matched different individuals at a genetic distance of 0.048 to 0.175. Conclusion Based on morphological characterization and DNA barcode comparison, the imported rodent sample was identified as B. indica. This species was captured for the first time at the port of Zhejiang province, which provided a reference to exclude invasion of exotic disease vectors.
Key words: Bandicota indica     Species identification     Mitochondrial cytochrome B gene     Port    

入境集装箱口岸卫生查验时,经常会检获各类医 学媒介生物,其中以鼠类最为常见。鉴别入境鼠样品 种类,对获得国外的鼠种分布信息,评估外来鼠种的输 入性风险,以及防控鼠传疾病有重要意义。由于货物 挤压、腐败等原因,在入境集装箱检获的鼠样本,往往 已经高度腐败变形,给形态学分类鉴定带来很大难 度。近年来,应用DNA条形码技术进行种属鉴定的研 究及应用发展迅速。该技术具有特异性强、灵敏度高、 易于观察与分析、对检材质量要求低等特点,与传统的 形态学方法比较具有明显的优势[1,2],同时该技术的出 现可以为研究物种的进化规律、遗传变异、系统发育以 及生物多样性提供理论依据。线粒体细胞色素B (cytB)基因具有母系遗传、高突变率、基因结构简单、 无组织特异性等特点,适合于种间、种下水平的鉴别研 究,是研究种及种下水平分类的理想分子标记[3,4,5]。本 研究尝试以形态学方法结合DNA条形码技术,对1例 入境集装箱中检获的鼠样品进行种类鉴别。 1 材料与方法 1.1 材料

2013年12月在沙特入境的集装箱中检获 1份鼠类样品残骸,标识为DX1312。 1.2 方法 1.2.1 形态学方法

观察鼠残骸的外部形态及测量其 头骨等有关数据。 1.2.2 分子生物学方法 1.2.2.1 基因组DNA提取

于鼠样品腹部用已灭菌 的手术剪剪取毛皮约0.5 cm2,放入2 ml离心管内,先 后用1.5 ml 75%无水乙醇和去离子水洗涤各3次,涡旋 振荡2 min,16 000×g高速离心1 min弃上清,取出样 品,剪成细小微粒并转移至另一干净的2 ml离心管中, 按照DNeasy Blood & Tissue试剂盒(Qiagen公司)使用 说明书提取DNA,于-20℃保存备用。 1.2.2.2 PCR扩增及序列测定

cytB基因扩增引物参 考文献[6],序列为:L7,5′-ACC AAT GAC ATG AAA AAT CAT CGT T-3′和H15915,5′-TCT CCA TTT CTG GTT TAC AAG AC-3′。PCR反应扩增体积为50μl,其 中10×缓冲液5μl,10mmol/LdNTP1μl,25μmol/L引 物各1μl,5U/μl Taq聚合酶0.4μl,模板DNA4μl。 PCR反应条件:95℃预变性5 min,94℃变性30 s, 55℃退火60 s,72℃延伸60 s,35个循环,最后再 72℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检 测后由上海英骏生物工程公司完成测序工作。 1.2.2.3 序列分析

测序所得的序列舍弃两端低信号 序列,进入NCBI进行Blast同源性检索。从GenBank 下载所有能够获得的板齿鼠(Bandicata indicacytB基 因序列为参考,用Mega 5.2软件进行系统发生分析,以 邻位相连法(NJ)构建系统发生树,分析用1000次往返 (replicate)。基因距离计算采用Nucleotide:Kimura 2-parameter方法,并采用Bootstrap方法分析不同鼠种 间cytB基因序列的遗传距离。 2 结 果 2.1 外部形态

已呈干尸状,皮毛破损严重,毛色呈 黑褐色,体长252 mm,尾长220 mm,后足长40 mm。 2.2 头骨

颅骨粗大,侧面观,鼻骨前端与上门齿前 喙在垂直线上,臼齿横叶状,横叶中间变向前方,第1 上臼齿具有3个横叶,第2和第3上臼齿只有2个横叶, 下臼齿亦呈横叶状。颅全长46.8 mm,颧骨长23.2 mm, 鼻骨长14.1 mm,上颊齿列长8.0 mm,听泡长10.8 mm, 门齿孔长8.0 mm。头骨及齿式见图 1

图 1 样品DX1312头骨及齿式
2.3 DNA条形码技术分析

将测序获得的样品 DX1312cytB基因序列录入GenBank进行Blast,结果显 示与板齿鼠R3521和R5313cytB基因序列最为相似, 同源性达95%。与不同板齿鼠的遗传距离为0.048~ 0.175。从分子系统发育树可知,样品DX1312与板齿 鼠、小板齿鼠(B. bengalensis)位于同一分支,而与缅甸 板齿鼠(B. savilei)形成独立分支(图 2)。

图 2 不同板齿鼠cytB基因关系树
3 讨 论

板齿鼠又称为大板齿鼠。在分类上属于鼠科 (Murida)鼠亚科(Murinae)板齿鼠属(Bandicota),该属 有3个种,另外还有小板齿鼠和缅甸板齿鼠,我国没有 分布[7]。从已有的监测报道可知,浙江省目前尚未有 板齿鼠的分布[8,9],此次从宁波口岸检获浙江省首例输 入性板齿鼠,对加强口岸医学媒介的查验和监测有较 大的指导意义。

由于检获样本不完整,依据毛色、体形等数据无法 对该样品的种类进行鉴定,因此,实验人员重点对头骨 进行了分析,头骨的测量数据、头骨形态特别是齿隙特 征均说明该鼠种为板齿鼠[10]。为了进一步核实该结 果,采用DNA条形码技术,对鼠样品皮毛中提取的 cytB基因序列进行了分析,分析结果与板齿鼠遗传距 离最为接近,因此可以确定该样品为板齿鼠。从系统 进化树可以获知,不能在GenBank获得与样品cytB基 因完全同源的板齿鼠,因此,分离样品与数据库的板齿 鼠存在一定的遗传进化差异。

志谢   论文成稿得到宁波出入境检验检疫局郑剑宁处长的指 导帮助,特此志谢

参考文献
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