我国是受肾综合征出血热（HFRS）危害最为严重 的国家，该病是由汉坦病毒（Hantavirus，HV）感染引起 的，每年报告发病数占全球总数90%以上^[1,2]。河北省 是HFRS的高发省份，自1981年发现首例患者至今，每 年都有病例发生。HFRS的具体发病机制尚不完全明 确，除有HV的直接作用外，机体的免疫状态和对HV 的遗传易感性等因素也发挥着重要作用^[3]。

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism， SNP）是在基因组上单个核苷酸的变异，其发生率在人 群中＞1%^[4]，并可导致机体对慢性损伤反应具有明显的 个体差异，影响人群对于疾病的易感性和疾病严重程 度。本研究从基因多态性入手，选取HLA-B及HLA-DQ 基因，应用等位基因特异性引物扩增（ASP-PCR）技术， 对河北省HFRS患者和健康人群HLA-B及HLA-DQ基 因上的5个SNP位点进行基因分型，探讨这些SNP位 点的基因多态性与HFRS发病的关联性，为疾病的易 感性提供遗传方面的证据，同时为该疾病预防及治疗 措施的研究和应用提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 实验标本

筛选HFRS患者阳性全血标本24份， 同时选择与病例相匹配的未检测到HV的健康人群全 血51份为对照组。标本由河北省疾病预防控制中心 病毒所提供。 1.2 SNP位点的选取与引物合成

通过NCBI查找与 疾病相关的SNP位点。选择HLA-B基因的SNP位点 rs71543422、rs34933313、rs41557013和HLA-DQ基因的 rs12722040、rs1142324。设计特异性引物（表 1），并由 上海生工生物技术有限公司合成。

表 1 SNP位点及其引物 Table 1 SNPs and primers in this study

表选项

将全血标本使用天根生物 的试剂盒进行基因组DNA的提取，-20 ℃保存备用。 1.4 ASP-PCR扩增

ASP-PCR反应体系共20 μl，其中 5×buffer（含Mg2＋）4 μl，上下游引物（10 μmol/L）各1 μl， dNTP（10 mmol/L）0.1 μl，Taq DNA 聚合酶2 U，模板 DNA 3.5 μl。反应条件：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性 30 s，59 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，循环35次扩增，循 环结束后72 ℃继续延伸7 min，扩增产物4 ℃保存。 1.5 电泳及结果判读

取8 μl PCR产物进行琼脂糖 凝胶电泳。根据电泳结果判读，若引物F1扩增出目的 片段，而引物F2没有，则此位点的等位基因型为M/M 型；如果引物F1和F2均扩增出目的片段，此位点的等 位基因型为W/M型；若引物F2扩增出目的片段，而引 物F1没有，此位点的等位基因型为W/W型。 1.6 数据分析

SNP位点的基因型频率采用直接计 数法获得，各位点基因频率的群体代表性使用哈-温 平衡法（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）。各SNP 位点基因型频率的差异性比较采用χ²检验（α＝0.05）。 2 结果 2.1 SNP位点基因型鉴定

75份标本在5个SNP 位 点上均扩增出目的片段，各位点不同基因型的鉴定结 果如表 2所示。

表 2 各SNP位点的基因扩增结果 Table 2 The genotyping results at each SNP site

表选项

将5个SNP位点基因 型的观察人数利用哈-温平衡定律进行检验。经统计分 析，各SNP位点实际基因型频率与理论基因型频率差异 无统计学意义，其分布均符合哈-温平衡，标本的选择有 较好的群体代表性（表 3）。

表 3 哈-温平衡检验 Table 3 Hardy-Weinberg equilibrium test for each SNP site

表选项

患者组和对照组在rs34933313位点CC基因型频 率分别为4.17%和29.41%，CG 为83.33%和54.90%， GG为12.50%和15.69%。CC和GG基因型频率患者组 均低于对照组，CG基因型频率患者组高于对照组，患 者组与对照组基因型频率的差异有统计学意义（χ²＝ 7.050，P=0.029），可以认为该位点的基因多态性会增 加人群感染HV的风险（表 4）。

表 4 患者组与对照组rs34933313位点基因型频率分布 Table 4 Genotype frequency distribution of rs34933313 between the case group and control group

表选项

rs41557013位点患者组和对照组CC基因型频率分 别为29.17%和23.53%，TT为20.83%和9.80%，CT 为 50.00%和66.67%，患者组与对照组基因型频率的差异 无统计学意义，尚不能认为该位点的基因多态性与疾病 的发生存在关系（χ²＝2.433，P=0.296）；rs71543422位点 的CC 基因型频率分别为37.50%和17.65%，TT 为 16.67%和15.68%，CT为45.83%和66.67%，患者组与对 照组基因型频率的差异无统计学意义（χ²＝3.871，P＝ 0.144），尚不能认为该位点的基因多态性与疾病的发 生存在关系；rs12722040位点的CC基因型频率分别为 12.50%和11.76%，TT为33.33%和31.37%，CT为54.17% 和56.87%，患者组与对照组基因型频率的差异无统计 学意义（χ²＝0.048，P=0.976），尚不能认为该位点的基 因多态性与疾病的发生存在关系；rs1142324位点的 CC基因型频率分别为12.50%和37.25%，TT为25.00% 和17.65%，CT为62.50%和45.10%，患者组与对照组基 因型频率的差异无统计学意义（χ²＝4.826，P=0.090）， 尚不能认为该位点的基因多态性与疾病的发生存在 关系。

综合以上结果可以看出，rs34933313位点的基因多 态性可能与HV感染有关，可能会增加人群感染HV的风 险。其余4个位点尚未发现其基因多态性与疾病的发生 存在关系。HLA-B基因可能与人群感染HV存在相关性。 3 讨论

HLA系统是目前所知人体最复杂的多态系统，在 机体的免疫系统中发挥着重要作用。具有高度的多态 性，一些遗传性状与疾病有着密切的关系，是研究疾病 易感性最不可忽视的遗传因素。HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ 类基因在调控机体实施免疫应答中发挥着重要作用。 本研究所选取的HLA-B、HLA-DQ基因即分别来自上 述基因^[5,6]。有报道显示HLA-B基因影响着人群对于 SARS的易感程度^[7]，但也有研究表示其基因多态性与 SARS的发生无关^[8]，可见HLA-B基因是否影响某些疾 病的发生还存在不确定性。

作为第3代遗传标记的SNP具有密度高、易分析 等优点。因此，该技术已经应用在复杂性疾病易患性 研究上，研究某个位点的基因频率与疾病之间的关联 性。目前已有阿尔茨海默病、乳腺癌、糖尿病、冠心病 等诸多复杂疾病完成了全基因组关联的分析研究^[9]。 病例对照研究是相关性研究经常使用的实验方法，通 过比较病例组和对照组之间遗传标记的差别，确定研 究人群对疾病的易感性或拮抗性与该遗传标记的关联 性。迄今为止，一些疾病的易感和拮抗基因已被成功 确定，如HLA-DR2基因与结核病和麻风病^[10]、SDF-1/ CCR/IL-10与艾滋病等^[11]。可见利用SNP进行关联分 析在研究中应用广泛和灵活，已成为揭示疾病和等位 基因间关联性的最佳方法。

通过分析HFRS 患者组和对照组在HLA-B 及 HLA-DQ基因上的5个SNP位点基因多态性可知，位于 HLA-B基因上rs34933313位点的基因多态性可能与 HV感染有关，可能会增加人群感染HV的风险。HLA-B 基因上的其余2个位点和HLA-DQ基因上的位点在本 次实验中尚未发现与HV感染相关。本实验证实HLA-B 基因与人感染HV存在关联，该基因可能在HV的感染 机制上起着重要作用，对于关联的强度大小，要想获得 更加肯定的结论，还需进一步扩大样本进行研究。 HLA-DQ基因上的2个SNP位点均未发现与人感染HV 存在关联性，可能与位点的选择有关，HLA-DQ基因与 人感染HV是否相关，还有待进一步研究。