斑点热（spotted fever）是由斑点热群立克次体 （Spotted fever group rickettsiae，SFGR）引起的一种人兽 共患自然疫源性传染病，其主要通过蜱、螨的吸血活 动在人和动物间传播，人因被携带有SFGR的蜱、螨叮 咬而感染，表现为发热、皮疹、虫咬皮肤溃疡、局部淋 巴结肿大等^[1]。我国至少存在10种斑点热流行^[2]。 北京市部分地区存在SFGR 的感染，1990 年和 1993年先后从北京市昌平区的刺猬身上收集的饱血 中华革蜱（Dermacentor sinicus）中分离出BJ-90株立克 次体和BJ-93株立克次体，尚无人类感染的报道^{[3, 4]}。 2013年我们对北京市昌平区SFGR感染进行了本底调 查，现将结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 主要试剂

聚合酶链反应试剂购自TaKaRa 公 司，组织核酸提取试剂购自Omega 公司，DH82 细胞 由本实验室保存。MEM 培养基购自吉诺生物制品 有限公司；胎牛血清和胰酶购自Gibco公司；100 U/ml 青链霉素，PBS缓冲液，Gimenez染色液均由本实验室 配制。 1.2 细菌分离

从北京市昌平区中国疾病预防控制 中心（CDC）园区刺猬身上收集到饱血蜱1只，经鉴定 为中华革蜱。先用PBS 洗涤3 次，放入75%乙醇中 30 min，再用PBS洗涤3次后研磨，加入500单位青链 霉素室温作用30 min。取1 ml悬液加入到长成单层的 DH82细胞中，35 ℃吸附1 h，期间轻轻摇晃3～4次，用 PBS洗去悬液，加入含5%胎牛血清和100单位青链霉 素的MEM培养液，置35 ℃，5% CO2条件下培养，连续 培养3代。培养7 d时刮去部分细胞涂片，Gimenez染 色并用油镜观察。 1.3 分子生物学检测

用Tissue DNA Kit提取第7天 细胞悬液DNA，用立克次体16S通用引物进行PCR鉴 定，基因扩增条件为94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30个循环，72 ℃延长10 min。将上述 扩增的PCR产物取5 μl 进行1%琼脂糖凝胶电泳，将 有目的条带大小的样本由北京擎科新业生物技术有限 公司进行序列测定。 1.4 序列分析

从GenBank中收集相关细菌的序列 信息，应用DNAStar 软件进行核苷酸序列比对， MegAlign分析核酸同源性，PhyML_3.0软件绘制细菌 系统发生树，确定细菌型别和基因差异程度。 2 结果 2.1 细菌分离

感染第7天可见细胞形态发生明显变 化，表现为细胞拉长，形态不规则，间隙增大和脱落 （图 1），在DH82细胞上连续感染3代后，能够产生稳 定病变，说明分离成功。

图 1 细菌在DH82细胞上的病变特征（×100） Figure 1 TCytopathic characteristics in DH82 cells caused by SFGR isolates（×100）

图选项

将感染第1代细胞涂片，Gimenez 染色，镜检，可见较多清晰的细菌被染成紫红色（图 2）。

图 2病变细胞（Gimenez染色，×1000） Figure 2 TGimenez staining of DH82 cells（Gimenez，×1000）

图选项

采用16S通用引物对细菌进行 PCR鉴定。结果显示，4个标本经PCR扩增后得到特 异性目的条带，将PCR产物进行回收，连接，测序，获 得的核苷酸序列大小为620 bp左右（图 3）。在NCBI Blastn进行比对，该序列与国际标准株西伯利亚立克 次体246株和西伯利亚立克次体BJ-90株相应核苷酸 序列的同源性均为100%。

图 3细胞中分离的细菌扩增16S 基因PCR结果 Figure 3PCR amplification of 16S gene of SFGR isolated from DH82 cells

图选项

选取GenBank 中立克次体属 SFGR 代表菌株和本研究中分离的西伯利亚立克次 体，进行序列比对，并基于Maximum likelihood方法构 建系统发生树。结果显示，CP1-1、CP1-3、CP2-4、 CP3-5、西伯利亚立克次体246株和西伯利亚立克次体 BJ-90株在同一分支上，并且与派氏立克次体（R. parkeri） 的亲缘关系较近（图 4）。

图 4 北京市昌平区分离的立克次体株16S基因核苷酸序列的系统发生树 Figure 4 Phylogenetic analysis of 16S gene of R. sibirica strains isolated in Changping district of Beijing,China

图选项

目前发现并证实具有致病性的13 个SFGR 中， 我国存在4种，分别是西伯利亚立克次体、黑龙江立 克次体（R. heilongjiangensis）、内蒙古立克次体 （R. mongolitimonae）和虎林立克次体（R. hulinii）^[5]，我 国已在黑龙江、新疆、内蒙古、北京、福建、海南、广东、 云南等地相继从蜱类、鼠类、蜱卵及患者标本中分离到 多株立克次体，经分子生物学鉴定分析，所有的分离株 均为西伯利亚立克次体，从而确认我国存在北亚蜱传 斑点热的病原体^[6]。 立克次体是一类专性细胞内寄生菌，分离纯化比 较困难，一直以来人们惯用实验动物感染法或鸡胚卵 黄囊感染法进行病原分离^{[7, 8, 9]}。因实验动物价格昂贵， 来源困难，影响实验动物因素多；鸡胚可能会产生对立 克次体和衣原体感染的抵抗。本次实验我们直接用细 胞培养法从感染样本中分离到立克次体^[10]，收到较好 的分离培养效果。 在北亚热的发生或流行中，蜱是其重要环节，不仅 是北亚热病原体的传播媒介，也是储存宿主，人被带菌 的蜱叮咬是其先决条件^[11]。蜱主要寄生在哺乳动物体 表。春季（3－4月）是蜱活动高峰季节，蜱爬至灌木杂 草顶端袭击过往的人和动物^{[12, 13]}。北京市昌平区中国 CDC园区内生态环境状况较好，经常有野生动物如刺 猬、黄鼠狼、鼠类等出现，上述动物身上携带大量蜱等 节肢动物。我们在不同时间多次从中国CDC园区的 刺猬体表寄生的中华革蜱中分离出立克次体，并经检 测后确定为西伯利亚立克次体，从而在病原学上证明 北京市昌平区存在北亚热自然疫源地的可能性。