阿拉善黄鼠（Spermophilus alaschanicus）与达乌尔 黄鼠（S. dauricus）形态特征相近，多年来国内外学者通 过多种方法试图分类鉴定，有的坚持认为阿拉善黄鼠 是独立种，有的将其归为达乌尔黄鼠的阿拉善亚种，长 期以来形成对阿拉善黄鼠分类地位的争议^[1]。为了寻 求2种黄鼠的鉴定方法，我们利用DNA 条形码技术， 对采自内蒙古自治区的达乌尔黄鼠和宁夏回族自治区 的阿拉善黄鼠标本细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ） 部分序列进行测定，计算其遗传距离，构建系统发育 树，现将结果报告如下。

阿拉善黄鼠采自我国阿拉善黄鼠鼠 疫疫源地核心地区宁夏海原县海城镇，达乌尔黄鼠采 自我国达乌尔黄鼠鼠疫疫源地核心地区内蒙古科右中 旗巴彦忙哈苏木。

所有试剂购自西安沃尔森生物技术有限 公司，引物合成及测序由北京奥科鼎盛生物科技有限 公司完成。

现场采集样本用无水乙醇 保存带回，剪取适量肝脏组织，加入ATL缓冲液和蛋 白酶K后，56 ℃水浴2～3 h，根据DNA提取试剂盒的 提取步骤制备DNA模板，测定其DNA含量。

PCR反应过程中，用通用引物及鸡尾酒引物扩增（引物序列见表 1）时，只有个别样品出 现条带但不清晰，经反复摸索，最终选用2次鸡尾酒引 物PCR扩增的方法，将第1次鸡尾酒引物扩增的产物 为模板，进行二次PCR，25 μl PCR反应体系包括：2× Taq Mastermix 12.5 μl，上下游引物各1 μl，模板2 μl。 扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退 火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环。2次PCR反应 体系及扩增条件相同。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝 胶电泳分析，若电泳图中出现目标条带即送样进行双 向测序，测序引物为F：TCA ACA ATC ACA AAG ATA TTG G；R：TCT GGG TGT CCA AAG AAT CA。如果实 验中样品出现非特异性条带，则重新进行PCR扩增。

表 1 扩增COⅠ基因的PCR引物序列 Table 1 PCR primer sequences used to amplify COⅠ gene

表选项

首先用Chromos软件观察测序 峰图质量，如果峰图质量很差如双峰等不能准确判断 碱基，则重新进行扩增和测序。运用Mega 5.0软件比 对各基因序列的碱基组成和变异，删除序列两端不能 完全对齐的碱基。基于Kimura-2-parameter（K2P） （Kimura，1980）模型计算各物种的遗传距离；采用邻接 法构建全部COⅠ基因序列的NJ系统树，对NJ树进行 内部分支检验与1000次Bootstrap检验分析，来确定各 支系的置信度。

选用鸡尾酒引物2次PCR扩 增的方法，11份阿拉善黄鼠、4份达乌尔黄鼠样本全部 获得COⅠ基因序列片段（序列长度约680～750 bp）。 2.2 COⅠ基因序列分析

通过对两地黄鼠获得的 COⅠ基因序列进行分析，相似度仅为92%～93%。运 用Mega 5.0 软件基于Kimura-2-parameter（K2P） （Kimura，1980）模型计算各样本的遗传距离，结果显示 （图 1），11份阿拉善黄鼠的种内遗传距离＜2%，4份达 乌尔黄鼠的种内遗传距离＜1%，两地黄鼠的遗传距离 介于8%～9%之间。

图 1 两地黄鼠样本COⅠ基因部分序列遗传距离差异分析 Figure 1 Analysis of genetic distance based on partial COⅠgene sequences of S. alaschanicus and S. dauricus samples

图选项

应用Mega 5.0软件构建的NJ 系统树见图 2，从图中可以看出，两地黄鼠样本分成2 个独立分支，支持阿拉善黄鼠为独立种。

图 2 两地黄鼠样本的NJ系统树 Figure 2 An NJ phylogenetic tree of S. alaschanicus and S. dauricus samples

图选项

关于阿拉善黄鼠的分类和鉴定一直存在争议，国 内许多专家采用多种方法进行鉴定。郑涛和王香亭^[2] 从形态特征和生态学进行分析，因他们在形态上有明 显差异，坚持阿拉善黄鼠为独立种。赵天飙等^[3]通过 黄鼠骨骼形态的模糊聚类分析认为阿拉善黄鼠为达乌 尔黄鼠的阿拉善亚种；秦长育和李克昌^[4]对宁夏黄鼠 与吉林达乌尔黄鼠进行形态学和生态学比较，也认为 宁夏黄鼠为达乌尔黄鼠的阿拉善亚种。付和平等^[5]对 阿拉善黄鼠模式产地——内蒙古南部典型荒漠区的样 本做了研究，发现不仅其形态特征与达乌尔黄鼠有显 著不同，而且其染色体数也是2n＝38，确认阿拉善黄 鼠为独立种；而研究中样本染色体数为2n＝36的种群 都是达乌尔黄鼠。

形态学和生态学方法是鉴定啮齿动物的常用基本 方法，但由于阿拉善黄鼠和达乌尔黄鼠在形态学和生 态学方面有较多相似和交叉之处，常用的鉴定手段难 以区分。染色体核型分析法是目前区分2种黄鼠的有 力依据，但近年来我国也有人（马继霞等，1985；晁玉庆 等，1994；郑涛等，1988）研究分析发现内蒙古各地与甘 肃省黄鼠的染色体数均为2n＝36，认为他们都是达乌 尔黄鼠^[1]，说明该法用于2种黄鼠的鉴定还存在不确 定性。

DNA 条形码是利用短的标准DNA 序列来鉴定物 种的一种行之有效的方法，因其片段小且易于获得而 被广泛应用于多个物种的种类鉴定工作中。线粒体 DNA 以母系遗传为主，基因重组率低，进化速率快，是 进行遗传进化和种群分类研究的良好材料。目前， 动物界物种鉴定普遍选用线粒体COⅠ基因作为条 形码^{[6, 7, 8]}。Hebert等^[9]对GenBank中同一个属的物种 COⅠ序列数据进行研究，结果表明种内的COⅠ序列 差异程度＜2%，绝大部分＜1%。马英等^[10]对青海省海东地区小型兽类110只样本的COⅠ基因进行序列 分析，发现种内遗传距离≤3%，种间遗传距离为5%～ 10%，属间遗传距离为12%～19%，科间遗传距离＞ 20%。本研究中，两地黄鼠的遗传距离介于8%～9% 之间，由此说明所测定的两地黄鼠为不同种，阿拉善黄 鼠为独立种。DNA条形码技术用于2种黄鼠的鉴别， 相对操作简便，结果稳定可靠，不失为目前2种黄鼠分 类鉴定的简便方法。

本研究建立了2种黄鼠的DNA条形码数据，为今 后2种黄鼠分类鉴定提供了基础依据。