医学媒介生物的鉴定和识别是监测与控制疾病发 生的基础，是检疫、疾病预防与控制领域的核心步骤， 经典的鉴定方法为形态学鉴定法。而国境口岸的媒介 生物随交通工具和货物散播的过程中可导致形态缺 失，形态学鉴定法难以正确识别种类。为解决上述难 题，加快口岸通关速度，以蝇类单后足代表微量组织为 研究对象，拟建立基于线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ （mitochondrial cytochrome c oxidase subunitⅠ，COⅠ）基 因的蝇类快速分子鉴定方法。

DNA 抽提试剂盒（DNeasy^® Blood & Tissue Kit，QIAGEN），双翅目国际通用引物〔LCO1490： 5′-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3′，HCO2198：5′-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3′，生工生物工程（上海）股份有限公司合 成〕，分子生物学试剂购置于TaKaRa公司。

自动电泳仪（AE8130，ATTO）、凝胶成像 系统（Molecular Imager^®，BIO-RAD）、生物安全柜 （SG-603，BAKER COMPANY）、冷冻高速离心机 （CT15RE，HITACHI）。

待测蝇类于烟台口岸使用诱蝇笼诱 捕法捕获，依据《中国常见蝇类检索表》^[1]、《中国重要 医学昆虫分类与鉴别》^[2]，对捕获蝇类进行形态学鉴 定，将完成鉴定的标本装入冻存管内，做好标记，放 入-70 ℃冰箱内保存待用。待测蝇类详见表 1。

表 1 蝇类标本信息 Table 1 Information of fly samples

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取蝇的单后足用DNeasy^® Blood & Tissue Kit试剂盒进行基因组DNA抽提；建立总体积为25.0 μl 的反应体系：10×PCR buffer 2.5 μl，25 mmol/L MgCl2 0.5 μl；10 mmol/L each dNTP Mix 0.25 μl，10 μmol/L LCO1490 0.5 μl，10 μmol/L HCO2198 0.5 μl，5 U/ml Taq DNA 聚合酶0.5 μl，DNA模板2.0 μl；反应程序设 定为94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，45 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共 5个循环；94 ℃ 30 s，51 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35个 循环；72 ℃ 10 min，进行COⅠ基因扩增。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳及纯化回收后，送生 工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定，序列 结果于NCBI、BOLD等数据库进行比对，报告蝇种。并 应用Mega 5.05软件对蝇类COⅠ序列进行系统发育 分析。

实验提取蝇 类基因组DNA，针对COⅠ序列进行有效扩增。由 PCR扩增结果可见（图 1、2），待检蝇种在略小于750 bp 下有特异性扩增条带，大小与文献中报道的COⅠ序列 相似^[3]。

图 1 1～11号蝇类样品COⅠ片段PCR扩增结果 Figure 1 PCR amplification of COⅠ fragments from flies labeled 1-11

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图 2 12～16号蝇类样品COⅠ片段PCR扩增结果 Figure 2 PCR amplification of COⅠ fragments from flies labeled 12-16

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与脊椎动物mtDNA相比，昆虫mtDNA富含更多 的A＋T，C＋G含量偏低^[4]。16只蝇类扩增的部分COⅠ 片段长度为690 bp，A、T、C、G碱基平均含量见表 2。COⅠ序列A∶T∶C∶G为29.30∶39.23∶15.45∶16.02，其中 A＋T含量高达68.53%，与各文献报道的含量高度相似。

表 2 蝇类COⅠ片段序列特点 Table 2 The sequence characteristics of COⅠ fragments of flies

表选项

将16只蝇类的COⅠ序列在NCBI上进行比对，其 结果与形态学鉴定结果相同，应用COⅠ序列对蝇类进 行分类鉴定可行。

采用k2p＋gamma 模型对16条COⅠ核苷酸序列 进行距离计算，矩阵结果见表 3。

表 3 COI序列距离矩阵（k2p＋gamma） Table 3 Kimura 2-parameter distance matrix,rates assumed to follow gamma distribution with shape parameter＝0.5

表选项

由图 3可见，同为 夏厕蝇的5、11号样品COⅠ基因同源性高达99%；9、 13号孕幼家蝇同源性为96%；孕幼家蝇与市蝇的基因 同源性为83%；但其他蝇种之间的COⅠ同源性均≤ 50%。

图 3 应用COⅠ数据通过ML法构建的蝇类严格一致树 Figure 3 The strict consensus phylogenetic tree of COⅠ gene in flies constructed with ML method

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与ML系统发育 树类似，NJ法构建的蝇类严格一致树，2只夏厕蝇（5、 11号）的同源性为97%，孕幼家蝇（9、13号）的同源性 为88%，其他蝇种间的同源性＜56%（图 4）。

图 4 应用COⅠ数据通过NJ法构建的蝇类严格一致树 Figure 4 The strict consensus phylogenetic tree of COⅠ gene in flies constructed with NJ method

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MP法构建的系统 发育树与NJ树高度一致（图 4、5）。

图 5 应用COⅠ数据通过MP法构建的蝇类严格一致树 Figure 5 The strict consensus phylogenetic tree of COⅠ gene in flies constructed with MP method

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综上所述，在应用COⅠ序列对蝇种进行分类鉴定 时，COⅠ序列种内差异多在5%以内，而种间差异多在 15%以外，种内差异远小于种间差异^[5]。显然，COⅠ序 列可理想地将同种蝇类划分在一起。

形态学鉴定是最为直观的分类方法，它借助分类 工作者的专业知识和记载形态学特征的论著直接得到 结论。但目前对蝇类进行形态学分类存在局限，如：蝇 类个体差异；蝇类存在隐存分类单元^{[6, 7]}，形态学鉴定 方法受蝇类发育阶段的限制^[8]，分类工作者经验是否 丰富，蝇类形态是否完整等。

线粒体基因的变异速度大约是核基因变异速度的 10倍。相比核基因，线粒体基因更合适于较低阶元的 系统发育关系的建立，每个物种都有唯一的COⅠ核苷 酸序列，种内的遗传差异很小，而种间差异又足够大用 以区分物种^{[8, 9]}。COⅠ基因长度为648 bp（5′末端开始 的58～705位）的片段区域被认为是DNA条形码编码 理想区域。每种生物都具有独一无二的DNA条形码 区域，该区域的碱基排序有4648种可能。因此对4648的 识别完全可以用于对目前已知的1000万种生物的鉴 定^[3]。并且，COⅠ基因本身存在很少的插入和缺失， 同时拥有蛋白质编码基因的共同特征——密码子第3 位碱基可以自由变异^[2]，足以包括所有的物种，而且种 间差异远超过种内差异^[10]。目前，COⅠ基因已用于多 种动物及植物的分类研究，动物分类研究较植物更为 成功，可成功对鱼类、鸟类、昆虫等进行分类^{[11, 12, 13]}。研 究显示，COⅠ对研究亲缘关系不是很远的昆虫系统发 育是十分适合的。

入境交通工具、货物中携带的媒介生物在运输途 中不易保持形态的完整性。如出现解剖结构的缺失， 将对形态学鉴定结果产生巨大影响，不同专家鉴定结果之间有可能出现差异。本研究结果显示，以单只蝇 的微量组织作为实验材料可有效扩增COⅠ基因，是解 剖结构缺失情况下进行分类鉴定的理想工具，准确性 高^[12]。传统的形态学鉴定对媒介生物形态的完整性要 求高，非成虫期的高度相似性和有些特征在不同的发 育时期不够稳定更增加了形态学鉴定的难度，不能保 证其鉴定的准确性，有学者成功地将DNA 条形码技术 应用到媒介生物的非成虫期物种鉴定上^{[14, 15]}，如卵、幼 虫、成虫的样本，不再需要长达数周的培养，再对成虫 进行鉴定，大大缩短了检测周期。

本研究应用DNA条形码技术，建立了COⅠ序列 扩增程序，序列比对结果显示形态学鉴定结果与COⅠ 序列比对结果一致。而且，COⅠ序列种内差异多在 5%以内，而种间差异多在15%以外，种内差异明显小 于种间差异。

应用DNA条形码技术进行分类鉴定的关键环节 之一，即要对扩增到的序列提交到数据库进行比对。 NCBI网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）GenBank数据 库囊括的序列种类广泛，将需要比对的序列输入后能 提供较多的类似序列。但也由于内容的广泛，导致某 一领域的不专业性，如COⅠ序列高度类似的情况下， 检索得到的蝇种却不一致。数据库中信息的正确有效 性直接影响到比对结果是否准确。生命的DNA条形 码数据库（BOLD，http：//barcodinglife.org/）是权威的条 形码数据库之一，是由加拿大Guelph大学构架和维护 的，供研究人员下载、管理和分析DNA条形码数据，数 据库不仅包括序列信息，还有完整的物种描述、标本图 片、地理分布信息等^{[16, 17]}。基于BOLD以及相应的检 测方法和技术，生命条形码联盟（CBOL，the Consortium for the Barcode of Life）成立，截止到2012年 8月，BOLD共收录179万余条严格通过审核的序列信 息，囊括了12余万物种，为全球物种鉴定工作提供了 有力的数据支持。但相对于自然界庞大的物种群来 说，由于数据库成立时间较短，加之从事条形码工作的 科技工作者比较局限，数据库的内容还没有足够丰富 以进行比对，数据库收录的物种COⅠ序列仍相对较 少。例如，BOLD数据库中关于家蝇科黑蝇属的条形 码信息仅有5条（斑蹠黑蝇1条，厚环黑蝇3条，Ophyra albuquerquei 1条），仅记载黑蝇属3个蝇种，不足以用 于比对工作，建立一个数据可靠，内容丰富的数据库是 条形码工作的一个关键环节。因此，条形码数据库需 要更多、更为严谨的条形码数据为分类鉴定学者提供 比对依据。这就对分子鉴定工作者提出新的要求， 即积极提供实验室科学、精准的实验结果，丰富数据 库数据。