运城市是山西省流行性乙型脑炎（乙脑）高发区， 最近十多年尤以临猗县的发病率居高。临猗县东南与 运城市接壤，西南与永济市毗邻，西濒黄河与陕西省相 望，北面峨眉峰与万荣县相连。为了解临猗县乙脑病 例高发乡镇蚊虫种类与密度、蚊虫乙脑病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）自然携带状况、JEV基因分型状 况，探索乙脑预警指标，我们于2009年6－8月对临猗 县蚊虫进行了相关调查，研究结果对深入探讨临猗县 乃至运城市乙脑发病原因、了解山西省JEV的基因分型及我国JEV基因型的时空变迁有重要意义，将为该 地区防控乙脑采取有效措施提供重要依据。 1 材料与方法 1.1 调查概况

2009年6－8月，选取临猗县乙脑发 病较多的4个乡镇进行蚊虫种类及密度调查。孙吉 镇、东张镇西邻黄河，两镇分别与东部耽子乡、临晋镇 接壤。将4个乡镇按行政区划均匀分区后，随机抽取 24个村，其中孙吉镇7个村，耽子乡5个村，临晋镇6 个村，东张镇6个村，每村抽取4个方位各1户农户进 行调查。4个乡镇所有样点村地处110°21′660″～ 110°36′814″N，35°01′924″～35°15′924″E。 1.2 调查方法

灯诱法捕蚊，诱蚊灯为功夫小帅光催 化灭蚊器（武汉吉星环保科技有限公司生产）。采集时 间为当晚日落至次日日出约10 h，数量为1盏/户。捕 获蚊虫经筛检，剔除雄蚊，分出种属后装入冻存管，液 氮保存。 1.3 JEV核酸检测及序列比对

对7、8月采集的三带 喙库蚊（Culex tritaeniorhynchus）进行JEV核酸检测及 核酸片段测序。使用TRIZOL法提取RNA，采用大连 宝生物工程有限公司TaKaRa primeScript^TM RT-PCR Kit 专用试剂盒进行RT-PCR，引物根据JEV NS1区设计，2 条引物的位置及序列分别为J1（2487-2506）：GTG CCA TTG ACA TCA CAA G，J3（2877-2896）：TGT CTC AGG TCC ATC TAC G，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴 定。电泳阳性样本进行核酸测序，用Bioedit进行核苷 酸序列比对，用Mega 5.0软件中的Neighbor-Joining法 （Bootstrap值设定为1000）进行系统进化分析。 2 结 果 2.1 蚊虫标本采集

共捕获蚊虫4属6种4424只，三 带喙库蚊占捕获总数的52.0%，为优势蚊种；其次为 淡色 库 蚊（Cx. pipiens pallens，41.2%）；中 华 按 蚊 （Anopheles sinensis）、背点伊蚊（Aedes dorsalis）、白纹伊 蚊（Ae. albopictus）及骚扰阿蚊（Armigeres subalbatus）较 少。捕获蚊虫最多的是孙吉镇，其次为临晋镇，耽子乡 及东张镇较少；乙脑主要媒介三带喙库蚊构成比耽子 乡最高（表 1）。

表 1 山西省临猗县4个乡镇蚊虫种类及构成比 Table 1 The species and constituent ratios of mosquitoes in four villages or towns in Linyi county of Shanxi province

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由图 1可见，6月蚊虫种 类最丰富的是孙吉镇、东张镇，孙吉镇、临晋镇、东张镇 蚊虫数量均在250只左右，耽子乡最少，＜40只；7月蚊 虫种类最丰富的是孙吉镇、临晋镇，各乡镇（除东张镇 外）蚊虫数量较6月显著增加；8月蚊虫种类最丰富且 数量最多的是孙吉镇，耽子乡及临晋镇蚊虫数量较7 月显著增多，东张镇蚊虫数量无显著变化。除东张镇 外，其他3个乡镇6－8月蚊虫数量逐渐增多；蚊虫种类 耽子乡最少，捕获3属4种，临晋镇、东张镇捕获蚊虫4 属5种，孙吉镇蚊虫种类最多为4属6种。

图 1 山西省临猗县2009年6－8月蚊虫种类及月度变化 Figure 1 Mosquito species and monthly variation in Linyi county of Shanxi province from June to August, 2009

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在受调查的96户 农户中，33户养猪，养殖规模不等，多数散养＜50头，3 户养猪数量＞100头。从捕获蚊虫与养猪的关系上 看，33户养猪户捕获蚊虫3470只，63户非养猪户捕获 954只；养猪户三带喙库蚊构成比较高（60.4%），非养 猪户淡色库蚊构成比较高（69.8%），其他蚊种在非养 猪户构成比稍高（表 2）。

表 2 山西省临猗县养猪户和非养猪户捕获蚊虫种类及数量 Table 2 The comparison of mosquito species and number between pig-breeding and non-pig-breeding farmers

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对7、8月捕获的三带 喙库蚊2109只分为77批进行JEV核酸检测，结果阳性 10批，批总阳性率为13.0%；7、8月批阳性率分别为 26.7%和9.7%。东张镇蚊虫均为阴性；孙吉镇7月为 阴性，8月批阳性率为3.4%；临晋镇7、8月批阳性率分别为25.0%和20.0%；耽子乡批阳性率较高，7月甚至 达到100%（表 3）。

表 3 山西省临猗县三带喙库蚊JEV核酸检测情况 Table 3 The detection of JEV sequences from nucleic acid of Cx. tritaeniorhynchus captured in Linyi county of Shanxi province

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对三带喙库蚊 JEV核酸阳性的5份样本（SXLY09-58、SXLY09-44、 SXLY09-66、SXLY09-79、SXLY09-78；其中孙吉镇1 份，耽子乡、临晋镇各2份）的扩增产物进行核酸测序， 用获得的JEV NS1区部分基因序列与来自GenBank中 的12株基因Ⅰ～Ⅴ型JEV相应序列进行系统进化分 析，结果显示，这5株JEV均为基因Ⅰ型（图 2）。

图 2 山西省临猗县5株JEV NS1区部分核苷酸序列系统发生树 Figure 2 The phylogenetic tree based on the partial NS1 sequences of five JEV isolates detected in mosquitoes captured from Linyi county of Shanxi province

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此次调查蚊虫种类和数量的变化规律与以往调查结果一致^[2,3]，6月蚊虫数量较少，7月增多，8月达到最 高；三带喙库蚊在6月偶然出现，7－8月构成比持续增 高达到70%左右。在调查中还发现，东张镇6－8月蚊 虫数量无增长甚至降低，可能因为调查时间和农户进 行药物杀灭时间间隔较短所致。蚊虫密度与养猪规模 呈正相关，随养猪数量的增加，蚊虫捕获数量亦增加。 养猪户捕获蚊虫数量占蚊虫总数的近80%，三带喙库 蚊绝大多数在养猪户中捕获，此与三带喙库蚊的生态 习性相一致。

方美玉等^[4]指出在蚊虫标本中JEV的阳性率可达 10%～20%，笔者此次调查发现，经核酸检测的三带喙 库蚊JEV批总阳性率为13.0%，个别农户捕获的三带 喙库蚊JEV批阳性率高达100%。由于核酸检测与细 胞培养在检测蚊虫样本JEV携带率上有所差异，加之 核酸检测亦有批次检验与单只检验的差别，因此蚊虫 标本JEV携带率的高低仍然需要统一标准来衡量。

孙玉杰和张海林^[5]综述了我国不同地区、不同年 代、不同来源的293株JEV的基因分型，2000年之前， 基因Ⅲ型JEV为我国主要流行型，2001－2005年为基 因Ⅰ、Ⅲ型混合流行期，2005年以后基因Ⅰ型为主要 流行型，在近30年中JEV发生了从基因Ⅲ型向Ⅰ型的 演变。在上述的293株JEV中，来自山西省的JEV有 12株，11株^[6]分离自2006年山西省运城地区乙脑暴发 时期，1株^[7]分离自2009年临猗一名82岁女性患者。 2006年分离的11株JEV中，6株来自患者，5株来自蚊 虫，基因Ⅲ和Ⅰ型JEV在患者及蚊虫中同时存在，2009 年分离的1株病毒为基因Ⅰ型。笔者对2009年采自临 猗县的三带喙库蚊进行JEV核酸片段检测，并对部分 阳性样本进行测序，NS1区的部分序列显示5个病毒样本均为基因Ⅰ型JEV，由于未进行病毒的细胞培养 及E基因序列的测定，进一步的实验对于揭示2009年 山西省JEV基因分型非常必要。近几年来，全国多省 包括东北^[8]、华北 ^[9]、华东 ^[10,11,12]、华中 ^[13]、西南 ^[14]已在蚊 虫中分离到基因Ⅰ型JEV，山西省蚊虫中单独分离到 基因Ⅰ型JEV尚属首次，仅限核酸水平检测，能以细胞 培养的方式分离到基因Ⅰ型JEV是需要努力的方向。

志谢   太原师范大学张猛和李敏老师在核酸序列比对中给予 指导和帮助，特此志谢