黑化反应是昆虫一种重要的先天性免疫防疫机 制^[1,2]，能够在感染或受伤的部位快速合成黑色素^[3]， 以便包裹病原物和促进伤口愈合，也参与昆虫卵壳褐 化、角皮硬化等多种反应^[4,5]。黑化反应的关键是酚氧 化酶（phenoloxidase，PO）的激活，PO催化酚类物质氧 化为醌，醌被聚合生成黑色素^[6]。在昆虫体内，PO一 般以非活化状态的酚氧化酶原（prophenoloxidase， proPO）形式储存在血细胞中，proPO一旦被激活便释 放到血淋巴，经限制性蛋白水解作用形成有活性的 PO，PO催化酚类形成不溶性的黑色素参与机体黑化 反应^[7]。昆虫黑化反应的变化与昆虫血淋巴的PO活 性变化紧密相关。因此，探讨有效的昆虫血淋巴PO活 性检测方法，对了解昆虫的黑化反应机制有重要意义。

家蝇（Musca domestica）属于昆虫纲，双翅目，具有 独特而有效的免疫防御体系，酚氧化酶原系统 （prophenoloxidase-activating system，proPO 系统）是家 蝇重要的免疫组分，proPO系统激活直接引起家蝇的 黑化反应。目前，除少量的对lectins和PO生化性质的 研究报道^[8,9]，对家蝇proPO系统激活的黑化反应以及 其proPO系统关键基因的功能还缺乏研究。我们曾采 用分光光度计法对病原入侵引起的家蝇体内PO活性 变化进行检测^[10]，其检测结果虽然能够反映家蝇的黑 化反应变化，但是需要的反应液体积过大、家蝇样本 多、耗时长、灵敏度和重复性较差。为了进一步了解病 原在体外刺激对家蝇血淋巴PO活性变化的影响，本研 究探讨了简单、方便、灵敏的96孔酶标板法检测家蝇 血淋巴PO活性的可行性。 1 材料与方法 1.1 材料

家蝇，本实验室饲养。大肠埃希菌 （Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus），本实验 室-20 ℃保存。 1.2 仪器

SW-CJ-JCU 超净工作台，苏州安泰空气技 术有限公司产品；酶标仪为Thermo Multiskan型号。 1.3 方法 1.3.1 试剂准备

多巴（L-DOPA）为美国进口分装，其 他试剂为国产分析纯。配制pH 7.0 的任氏液 （Ringer）：NaCl 110.5 mmol/L、KCl₂ mmol/L、NaHCO₃ 2.4 mmol/L、NaH₂PO₄ 0.083 mmol/L、EDTA 20 mmol/L。 配制pH 7.0的1×PBS缓冲溶液：KH2PO₄ 1.76 mmol/L、 Na₂HPO₄ 10.14 mmol/L、KCl 2.7 mmol/L、NaCl 140 mmol/L。20 mmol/L多巴溶液现用现配，与25 μg/μl 的抗生素（氨苄西林）都是抽滤除菌。170 mmol/L CaCl₂、 1×PBS、Ringer液以及0.8%生理盐水均高压灭菌。 1.3.2 菌液准备

在超净工作台上用接种环取少量菌 液接种到5 ml 液体LB中，37 ℃水浴200 r/min振荡培 养12 h。4200×g 离心5 min，收集菌体，用计数器在显 微镜下计数，用LB调菌浓度为1.84×10⁹ cfu/ml，混菌 1∶1混合，4 ℃保存。 1.3.3 家蝇3龄幼虫血淋巴的提取

挑取正常的3龄 幼虫，置于培养皿中，用0.8%生理盐水清洗2次，然后 取出幼虫，置于吸水纸上，吸净幼虫表面的生理盐水， 再移幼虫至倒扣在冰块上的培养皿上，剪去幼虫头端， 用移液枪在剪口处吸取幼虫的血淋巴置于预冷的 Ringer液中混匀，抽滤除菌，冰上放置待用。 1.3.4 样品与反应液准备

按表 1准备待检测的样 品：先吸取家蝇3龄幼虫的血淋巴到预冷的Ringer液， 再迅速加入菌液。每种样品有3个重复和1个空白对 照（其中的血淋巴用Ringer液替代）。样品液体积为 150 μl。待检测样品包括3种含不同菌量的实验样品 和1种不加菌的正常对照样品。

表 1 样品配制方案 Table 1 The protocol for sample preparation

表选项

反应液准备：180 μl的体系，包括待检测的样品 30 μl、1×PBS 90 μl、170 mmol/L CaCl₂ 30 μl、20 mmol/L 多巴溶液30 μl（检测时现加）。 1.3.5 酶标仪检测反应液的A₆₃₀和A₄₉₀

先把不含多巴 溶液的反应液混匀，放入96孔酶标板中，再将96孔酶 标板放回酶标仪中，让其在酶标仪中30 ℃振荡孵育 10 min，然后向反应液中加30 μl多巴溶液，在同样条 件下继续反应，读取反应时间内待测溶液的A₆₃₀和A₄₉₀ 值，每隔5 min重复检测1次。酶标仪设定程序：30 ℃ 孵育→检测A₆₃₀→检测A₄₉₀→振荡5 min重复检测。最 后，以反应时间为横坐标，以记录的每个样品3次重复 与空白的A 差值的平均数作纵坐标，绘制家蝇血淋巴 的A值随反应时间的变化曲线。 2 结果 2.1 混菌刺激对家蝇血淋巴黑化反应影响的检测

对加E. coli 和S. aureus 混菌不同量的3种样品和不加 E. coli 和S. aureus 混菌的正常样品用酶标仪进行检测， 记录样品在60 min内的A₆₃₀和A₄₉₀值，根据这些数据做 它们的变化曲线（图 1）。

图 1 家蝇血淋巴的A630和A490随E. coli和S. aureus混合菌体外 刺激不同时间的变化曲线 Figure 1 The changes in A630 and A490 with stimulation time in housefly hemolymph challenged by the mixture of E. coli and S. aureus in vitro

图选项

样品1～3含有E. coli 和S. aureus 混菌的起始个数 分别为2.76×107、8.28×107和1.38×108 cfu，正常为不 加E. coli和S. aureus混菌的对照。

相比正常的起始A₆₃₀ 值，样品1～3 的A₆₃₀ 值为 0.17～0.44，含菌量越多的样品，其A₆₃₀值也越大。在随 后的60 min反应时间内，所有检测品的A₆₃₀值都随反应 时间的延长而不断增加，与起始A₆₃₀值相比，60 min样 品1～3的A₆₃₀值依次增加了3.80、2.40和3.50倍。样品 含菌量越多，其A₆₃₀值越大，形成了从上到下类似平行 排列的随反应时间不断上升的3条曲线，含菌量越多 的样品曲线越靠上，最下面的是样品1的曲线。说明 样品1～3随反应时间延长，其中的细菌数不断增加， A₆₃₀值越来越大。

样品1～3的A₄₉₀值增加的趋势与其A₆₃₀值增加的 趋势基本一致。就单一检测点来看，相比正常的A₄₉₀ 值，样品1～3中添加了E. coli 和S. aureus 混菌，其A₄₉₀ 值增加明显，加菌量越多，其A₄₉₀值增加的也越多。检 测的起始数据显示：相比正常的A₄₉₀ 值，样品1～3的 A₄₉₀值分别增加了1.40、2.40和3.80倍。另外，在检测 的60 min内，所有样品的A₄₉₀值均随反应时间延长而增 长，相比它们各自起始的A₄₉₀ 值，60 min样品1～3 的 A₄₉₀值增加的倍数依次为3.20、2.10和2.70倍。说明起 始样品中加入E. coli 和S. aureus 混菌的量越多，样品 起始A₄₉₀值越大，同时，反应时间越长，样品的A₄₉₀值也 不断增加，引起样品的PO活性增高，产生的黑色素增 多，引起的黑化反应越强。

显然，家蝇血淋巴受体外刺激的E. coli和S. aureus 混菌浓度越大、时间越长，其PO活性提高越快，导致的 黑化反应越强。 2.2 单菌刺激对家蝇血淋巴黑化反应影响的检测

按表 1准备了分别加E. coli、S. aureus 和M. luteus 3种 单菌的样品，利用与检测混菌刺激对家蝇血淋巴黑化 反应影响的同样方法，用酶标仪记录不同菌量和不同 类型的单菌体外刺激家蝇血淋巴的A₆₃₀和A₄₉₀值，并依 此制作相应的曲线图。样品1～3含有单菌的起始数 分别为2.76×10⁷、8.28×10⁷和1.38×10⁸ cfu，正常为无 菌对照，抗生素为加氨苄西林的对照。 2.2.1 E. coli刺激对家蝇血淋巴黑化反应的影响

图 2 是酶标仪记录的样品在90 min反应时间内家蝇血淋巴 的A₆₃₀ 值与A₄₉₀ 值随不同量E. coli 体外刺激的变化曲 线。加E. coli 样品1～3的A₆₃₀曲线起点比较集中，其 A₄₉₀曲线的起点也相对集中，正常与加氨苄西林的曲线 起点相同，说明反应初期，1～3样品中的E. coli 菌数 差别不大，几乎检测不到黑化反应的差别。检测样品 的起始A₄₉₀数据也证实了这点：相比正常的A₄₉₀值，样品 1～3的A₄₉₀值分别增加了1.33、1.36和1.38倍，E. coli菌 量越多的样品其A₄₉₀、A₆₃₀值也越大，其增幅明显低于与 E. coli 和S. aureus 混菌刺激的效果。在90 min反应时 间内，无菌正常对照的A₄₉₀值几乎不变，而加E. coli 的 样品1～3的A₄₉₀、A₆₃₀值均随反应时间延长明显增加， 而且A₄₉₀ 值与A₆₃₀ 值增加趋势一致。相比E. coli 和 S. aureus 混菌刺激，E. coli单菌刺激的样品A₄₉₀、A₆₃₀值增 幅在60 min时更大，与对照的差别更明显，推测E. coli 单菌刺激的效果应在反应后期。显然，随反应时间延 长，样品1～3中的E. coli 量越来越多，引起样品中的 PO活性越来越高，产生的黑色素越来越多，样品的黑 化反应越来越强；加氨苄西林对照中的E. coli 被杀死， 检测到的样品A₄₉₀值恒定，其PO活性几乎不变，产生的 黑色素一直未增加；正常对照随反应时间延长，其血淋 巴中的血细胞可能破裂，少量的proPO蛋白会被激活 使PO活性略有提高，检测到A₄₉₀值有少许增加。因此， E. coli体外刺激较长时间后能明显引起家蝇血淋巴PO 活性的提高。

图 2 家蝇血淋巴的A630和A490随E. coli单菌体外刺激 不同时间的变化曲线 Figure 2 The changes in A630 and A490 with stimulation time in housefly hemolymph challenged by E. coli in vitro

图选项

用酶标仪记录按表 1加不同量S. aureus的样品在90 min 内的A₆₃₀和A₄₉₀值，样品中的血淋巴没有抽滤除菌（图 3）。

图 3显示，样品1～3含有的起始S. aureus 菌量依 次增加，其起始A₆₃₀值有明显不同，随反应时间延长，它 们的A₆₃₀值也在不断增加，说明其中的菌不断增殖，但 是速度比图 2中的E. coli 要慢。同样，也比较了样品 1～3 的起始A₄₉₀ 值与正常的A₄₉₀ 值的比值，结果为 1.30～2.40倍，增幅略高于E. coli，但明显低于E. coli和 S. aureus混菌的增幅；在90 min内，正常样品起初少量 的菌也在增殖，但量低于加S. aureus 的样品1～3，引起 的PO活性略有提高，其A₄₉₀值略有上升，幅度小于加 S. aureus 的样品1～3；加氨苄西林的抗生素样品A₄₉₀值 略有下降，说明其中起始较高量的菌被氨苄西林抑杀， 使PO活性变低，引起A₄₉₀值略有下降；样品1～3的A₄₉₀ 值增加趋势与其A₆₃₀值相似。说明反应液中S. aureus浓 度越大，引起同量血淋巴的PO活性越高，产生的黑化反 应越强。

图 3 家蝇血淋巴的A630和A490随S. aureus单菌体外刺激 不同时间的变化曲线 Figure 3 The changes in A630 and A490 with stimulation time in housefly hemolymph challenged by S. aureus in vitro

图选项

用酶标仪记录按表 1 加不同量M. luteus 的反应液在 90 min内的A₆₃₀和A₄₉₀值，根据这些数据做曲线图（图 4）。 样品中的血淋巴未抽滤除菌。

图 4 家蝇血淋巴的A630和A490随M. luteus单菌体外刺激 不同时间的变化曲线 Figure 4 The changes in A630 and A490 with stimulation time in housefly hemolymph challenged by M. luteus in vitro

图选项

样品1～3含有的M. luteus 浓度同前，也是依次增 加。在90 min内，测得的A₆₃₀值与A₄₉₀值也依次增加，增 加幅度比含S. aureus 的相同样品要高，比含E. coli 的 相同样品要低，但是，其起始A₄₉₀值与正常A₄₉₀值的比值 最大，分别为2.60、2.80和3.00倍，该数据在单菌刺激 中是最大的，其3 号样品的比值（3.00 倍）略低于E. coli 和S. aureus 混菌（3.80倍）。正常样品起初有少量 的菌，但未加S. aureus，其PO活性随反应时间略有提 高，A₄₉₀值略有上升，幅度小于加S. aureus 的样品1～3； 加氨苄西林的抗生素样品起初含有的S. aureus 菌量与 样品2相当，但被氨苄西林有效抑杀后，样品的PO活 性基本不变，A₄₉₀ 值保持恒定。显然，反应液中起始 M. luteus 浓度越大，引起同量血淋巴的黑化反应越强， 其作用强度比S. aureus 与E. coli 强，略弱于E. coli 和 S. aureus混菌。 3 讨论

黑化反应是家蝇重要的先天性免疫防御机制，当 外源性物质入侵时，家蝇体内的proPO系统被激活，使 proPO形成PO，引起黑色素和毒性物质生成，抵御入侵 物^[10]。本研究发现，在体外，免疫刺激物不同，引起的 家蝇幼虫血淋巴的黑化反应不同。

当用E. coli、M. luteus、S. aureus 单菌或E. coli 与 S. aureus 混菌体外刺激家蝇3龄幼虫的血淋巴时，96 孔酶标板法能够检测到菌刺血淋巴的PO活性快速提 高。在90 min的检测时间内，随时间延长，无菌刺的正 常家蝇血淋巴A₄₉₀缓慢增加，而菌刺样品的A₄₉₀快速增 加，增加的幅度与刺激菌的浓度成正比，加抗生素的样 品A₄₉₀基本不变。从而证明：在体外，家蝇血淋巴受菌 刺激会促进其中的proPO激活产生大量的PO；没有病 原刺激，正常血淋巴中的proPO也会有少许被激活产 生少量的PO。PO催化反应液中的多巴生成黑色素而 使样品的A₄₉₀增加。

另外，在一定的反应时间内，合适的菌浓度范围 （1.38×10⁷～1.38×10⁸ cfu）下，体外刺激菌的浓度越 大，对血淋巴中proPO的激活作用越强，导致的黑化作 用越明显。从4种菌刺的检测曲线来看，使用除菌血 淋巴检测菌刺效果更明显，E. coli 和S. aureus 混菌刺激 引起家蝇血淋巴A₄₉₀的变化与单菌刺激的类似。从检 测到的4种菌刺样品起始A₄₉₀值与正常的A₄₉₀值比率来 看，3 种单菌刺激的效果是M. luteus＞S. aureus＞ E. coli，而E. coli 和S. aureus 混菌刺激的效果要比单菌 刺激的效果好，而且，刺激菌的浓度越大，引起家蝇血 淋巴的黑化反应越明显。

王秀华等^[11]曾探讨96孔酶标板法检测对虾血淋 巴过氧化物酶活性的优势，那些优势在本研究中也体 现得更为充分。①节约试剂。以前检测家蝇的黑化反 应用分光光度计法，反应液要3 ml，是96孔酶标板法 180 μl反应液的17倍，分光光度计法检测1个样品用 的血淋巴量为20 μl，若重复检测3次就需要至少60 μl 的血淋巴，是96孔酶标板法使用血淋巴量的7倍。② 简单快速。分光光度计法每次只能检测1个样品，而 96孔酶标板法1次可以同时检测多个样品。③稳定灵 敏。分光光度计法每次检测需要人工调试，获得的重 复数据间误差较大，96孔酶标板法只需将每个样品定 容，完全自动检测，数据稳定。总之，96孔酶标板法比 分光光度计法用于检测家蝇血淋巴的黑化反应更加方 便快捷。