2025, Vol. 36
RNA干扰技术应用于媒介生物防治的研究进展
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文章信息
- 张健, 郭云海, 开振鹏, 蒋天哥, 张仪
- ZHANG Jian, GUO Yun-hai, KAI Zhen-peng, JIANG Tian-ge, ZHANG Yi
- RNA干扰技术应用于媒介生物防治的研究进展
- Research progress of RNA interference technology applied to vector control
- 中国媒介生物学及控制杂志, 2025, 36(1): 129-136, 143
- Chin J Vector Biol & Control, 2025, 36(1): 129-136, 143
- 10.11853/j.issn.1003.8280.2025.01.022
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文章历史
- 收稿日期: 2024-04-12
张健, 郭云海, 开振鹏, 蒋天哥, 张仪. RNA干扰技术应用于媒介生物防治的研究进展[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2025, 36(1): 129-136, 143.
ZHANG Jian, GUO Yun-hai, KAI Zhen-peng, JIANG Tian-ge, ZHANG Yi. Research progress of RNA interference technology applied to vector control[J]. Chin J Vector Biol & Control, 2025, 36(1): 129-136, 143.
RNA干扰技术应用于媒介生物防治的研究进展
1 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心)媒传热带病室, 上海 200025;
2 上海应用技术大学化学与环境工程学院, 上海 201418;
3 上海交通大学医学院-国家热带病研究中心全球健康学院, 上海 200025
2 上海应用技术大学化学与环境工程学院, 上海 201418;
3 上海交通大学医学院-国家热带病研究中心全球健康学院, 上海 200025
摘要: RNA干扰（RNAi）是一种高效的分子调控手段，通过特异性地降低靶标基因的表达水平，对害虫的生物学特性产生影响。蚊、蜱、淡水螺和螨是传播多种致命疾病的重要媒介生物，RNAi技术在媒介生物防治的应用显示出了巨大的潜力。该文综述了RNAi技术在蚊、蜱、淡水螺和螨类等基因功能研究中的应用，尤其是在影响其繁殖能力、生长发育、神经和代谢功能以及免疫和病毒传播等基因方面的应用。此外，文章还探讨了影响RNAi效率的多种因素，包括双链RNA（dsRNA）的长度、浓度、给药途径和转染方法等，讨论了RNAi技术在实际应用中面临的挑战，并展望了RNAi技术在媒介生物防治中的潜力，旨在为未来的媒介生物防制管理策略提供新的途径和方法。
关键词:
RNA干扰 媒介生物 干扰效率
Research progress of RNA interference technology applied to vector control
1 National Institute of Parasitic Diseases, Chinese Center for Disease Control and Prevention (Chinese National Tropical Diseases Research Center) Vector-Borne Tropical Diseases Department, Shanghai 200025, China;
2 School of Chemical and Environmental Engineering, Shanghai Institute of Technology, Shanghai 201418, China;
3 Global Health Institute, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (Chinese Center for Tropical Diseases Research), Shanghai 200025, China
2 School of Chemical and Environmental Engineering, Shanghai Institute of Technology, Shanghai 201418, China;
3 Global Health Institute, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (Chinese Center for Tropical Diseases Research), Shanghai 200025, China
Abstract: RNA interference (RNAi) is an efficient molecular regulatory method that specifically reduces the expression levels of target genes, thereby affecting the biological characteristics of pests. Mosquitoes, ticks, freshwater snails, and mites are key vectors for the transmission of various deadly diseases. RNAi has shown great potential in the control of vectors. This article reviews the application of RNAi technology in gene function research of mosquitoes, ticks, freshwater snails, and mites, especially the genes that affect reproductive capacity, growth and development, neural and metabolic functions, as well as immune response and virus transmission. In addition, the article discusses various factors that affect the efficiency of RNAi, including dsRNA length, concentration, administration route, and transfection methods. This article addresses the challenges faced by RNAi technology in practical applications and the potential of RNAi technology in vector control. The results provide new approaches and methods for advancing future vector control management strategies.
Key words:
RNA interference Vector Interference efficiency
1 引言
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种由双链RNA（dsRNA）介导的序列特异性转录后基因沉默机制。这一现象最初由Andrew Z. Fire和Craig C. Mello于1998年在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中发现。随后，科学家们对RNAi的分子机制和潜在应用进行了深入研究和探索[1-3]。RNAi作用机制示意图见图 1[4]，RNAi的启动过程始于内源或外源dsRNA前体进入细胞。长链dsRNA进入细胞后，首先被核糖核酸内切酶（Dicer酶）识别和切割。Dicer酶是RNase Ⅲ家族的成员，特异性识别双链RNA，并作为分子标尺将其切割成21至25个碱基对（bp）的小片段，这些小片段被称为小干扰RNA（siRNA）。siRNA随后与RNA诱导的沉默复合体（RNA induced silencing complex，RISC）结合，其中siRNA的一条链（引导链）被整合到Argonaute蛋白上——Argonaute蛋白是RISC的核心组成部分，而RISC是由Argonaute蛋白、Dicer和dsRNA构成的复合体。在整合过程中，siRNA的另一条链（乘客链）被Argonaute蛋白切割并释放。随后，Argonaute蛋白利用siRNA引导链与包含完全互补序列的靶标mRNA结合，并切割靶标mRNA。被切割的mRNA随后被RISC释放并降解，从而抑制了靶标基因的表达，而RISC复合体则可重新用于下一轮的切割过程[5]。多细胞生物体内还可以发生系统性RNAi，这是沉默信号从一个细胞传递到另一个细胞，或从一个组织传递到另一个组织的过程[6]，从而放大沉默效应。系统性RNAi已在多种生物中观察到，包括植物[7]、昆虫[8]和脊椎动物[9]。
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| 注：图引自Cuccato，et al（2011）[4]；Step 1细胞内的双链RNA（dsRNA）通过由Dicer酶介导的反应引发RNA干扰，Dicer酶将dsRNA切割成21~23 bp的小干扰RNA（siRNA）片段；Step 2 siRNA被装载到RNA诱导的沉默复合体（RISC）中，其中一条链（乘客链）被降解丢弃，而引导链则保留在RISC中，作为沉默反应的模板；Step 3引导链组装成一个功能性的siRNA-RISC复合体，该复合体包含与Argonaute（Ago）蛋白结合的siRNA，然后通过碱基配对，siRNA-RISC复合体识别并结合靶标mRNA；Step 4诱导mRNA降解，靶标mRNA从siRNA解离，siRNA-RISC复合体被释放，循环使用。 图 1 RNA干扰作用机制示意图 Figure 1 Schematic diagram of RNA interference mechanism |
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媒介生物，也称病媒生物，它们能够传播多种致命疾病，例如疟疾、登革热、血吸虫病、利什曼病、黄热病和流行性乙型脑炎等。这些疾病每年造成超过一百万人的死亡，尤其在热带和亚热带地区，它们对人类健康构成了巨大的威胁。主要的媒介生物包括蚊、蝇、蜱、螨和淡水螺类等[10]。虽然化学农药的广泛使用在媒介生物的防治方面取得了一定的成果，但随之而来的还有一系列问题，如媒介生物对农药的抗药性增强、对非目标生物的毒性以及对环境的污染，这些问题促使人们寻求更为环保和可持续的防治策略。RNAi技术以其高效性和特异性，为媒介生物的控制提供了一种创新的解决方案。2023年12月22日，一个重要的里程碑被达成：Ledprona（商品名CalanthaTM）在美国注册，成为美国环境保护局（US-EPA）批准的首个基于RNAi的可喷洒活性成分。这一批准标志着基于RNAi的生物农药技术向前迈出了坚实的一步，为未来的媒介生物防治工作开辟了新的可能性[11]。
蚊、蜱、淡水螺和螨类是传播多种致命疾病的重要媒介生物，并且在RNAi技术应用方面显示出了巨大的潜力。本文综述了RNAi在蚊、蜱、淡水螺和螨类等几种媒介生物防治中的应用和最新研究进展，尤其是在影响媒介生物繁殖能力、生长发育、神经和代谢功能以及免疫和病毒传播等基因上的应用，有助于开发预防和控制媒介生物传播疾病的新策略和新方法。
2 RNAi应用于媒介生物 2.1 RNAi应用于蚊虫蚊虫是众多病毒性病原体的关键传播媒介。近年来，城市化和气候变化的加剧导致蚊媒的活动范围显著扩大。在过去10年中，全球多国报告了黄热病、西尼罗热和流行性乙型脑炎等由蚊虫传播的病毒性疾病病例数量的显著增加。由于目前缺乏有效的医疗干预手段，控制这些蚊媒传播的病毒性疾病变得极具挑战性。伊蚊属（Aedes）和库蚊属（Culex）蚊虫在全球范围内是重要的蚊媒病毒传播者。伊蚊属的蚊虫是登革病毒（DENV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）、黄热病毒（YFV）和寨卡病毒（ZIKV）的主要传播媒介，而库蚊则主要传播流行性乙型脑炎病毒（JEV）、西尼罗病毒（WNV）和辛德比斯病毒（SINV）[12]。RNAi技术在蚊媒研究领域发挥着重要作用，特别是在基因功能研究和潜在控制靶标的发现方面，它极大地加深了我们对特定基因在蚊媒中作用机制的理解[13]。
2.1.1 影响繁殖能力基因的RNAi为了研究血管紧张素转换酶（ACE）在淡色库蚊（Cx. pipiens）繁殖过程中的作用，通过将siACE微量注射入其血淋巴，发现降低ACE的表达能够有效抑制雄性和雌性库蚊的繁殖能力[14]。针对芳烷基N-乙酰转移酶7（aaNAT7）的RNAi实验显示，它能够降低雄性埃及伊蚊（Aedes aegypti）的繁殖力，但对雌蚊孵化率没有显著影响[15]，而MDR49（multi drug resistance 49）基因的敲减导致埃及伊蚊在吸血后VgA1基因（与卵黄膜锚定有关）表达显著下降，进而导致产卵数量和孵化率降低[16]。RNAi介导的埃及伊蚊的离子转运肽（AedaeItp）表达下调，致蚊虫排泄量增加。同时，AedaeItp及其选择性剪接变体AedaeItp-L的表达下调，能够减少雌性伊蚊的吸血量和产卵量，并且降低卵的存活率，这表明它们可能在摄食行为以及生殖过程中发挥着重要作用[17]。对埃及伊蚊雌激素相关受体（ERR）进行RNA干扰，导致雌性伊蚊卵巢发育延迟，这揭示了埃及伊蚊ERR（AaERR）在调节蚊虫繁殖过程中的代谢活动中扮演着关键角色[18]。在雌性埃及伊蚊中，通过RNA干扰技术实现的60S酸性核糖体蛋白P1基因的沉默，引发了显著且短暂的基因敲除效果，并在卵巢长度和卵沉积方面引起了可观察到的表型变化，这表明60S酸性核糖体蛋白P1是蚊虫繁殖的关键因素，为蚊虫种群控制提供了一个有潜力的干预靶点[19]。
2.1.2 影响生长发育基因的RNAi几丁质是昆虫生长发育所必需的，但在高等动植物中缺乏。通过RNAi沉默白纹伊蚊（Ae. albopictus）四龄幼虫的几丁质基因CHS -2，发现在伊蚊幼虫中几丁质代谢相关基因的表达上调，中肠几丁质含量有所降低但活性未受到影响，然而，中肠上皮出现空泡化、细胞内陷和部分细胞破裂现象，围食膜结构遭受破坏甚至缺失。因此CHS -2通过调节几丁质代谢途径的相关基因，影响中肠几丁质的合成和分解过程，并参与中肠围食膜的形成，对生长和发育发挥重要作用[20]。RNAi介导的Rel1和Rel2基因（分别是Toll和IMD通路的转录因子）的沉默显著降低了成年埃及伊蚊的存活率、飞行运动能力，以及其抗真菌活性和抗菌肽的表达水平，从而导致蚊虫的整体适应性下降[21]。AaCPR100A是埃及伊蚊软角质层中的一种结构蛋白，赋予昆虫以柔韧性和弹性，从而允许它们自由地移动或飞行，靶向AaCPR100A的RNA干扰导致埃及伊蚊的幼蚊和成蚊死亡率显著增加，同时卵的孵化率也显著降低。G12样蛋白是与AaCPR100A相互作用最为紧密的蛋白质之一。经过G12样蛋白基因的dsRNA处理，成虫对低温的敏感性增加，卵壳的形成和孵化过程均受到抑制。G12样蛋白与AaCPR100A可能通过相互作用，共同参与埃及伊蚊表皮的发育和卵壳的形成过程[22]。最近，利用商业小干扰RNA（siRNA）和体外转录的dsRNA对阿拉伯按蚊（Anopheles arabiensis）中与蜱虫亚基素同源的基因Akirin进行了RNAi研究，发现经过Akirin dsRNA处理的蚊虫，在接种后的平均存活时间仅为15 d，这显著缩短了它们的预期寿命，可能有效降低它们传播疟疾的效率[23]。
利用蚊虫共生肠道细菌介导的RNAi控蚊是一种新方法。通过敲除其RNase Ⅲ基因对居泉沙雷菌（Serratia fonticola）进行改造，并靶向斯氏按蚊（An. stephensi）的保幼激素受体基因Met和蜕皮激素受体基因EcR，构建的重组共生菌能在蚊幼虫的肠道中定植，并产生特异性的dsRNA，如dsMet或dsEcR，以触发RNAi反应。改造后的居泉沙雷菌菌株显著延缓了斯氏按蚊幼蚊的发育进程，并导致其高死亡率，这一成果为昆虫基因沉默提供了一个高效的dsRNA传递系统，也为害虫控制开辟了一种基于RNAi的新型策略[24]。
2.1.3 影响神经系统、代谢功能基因的RNAi5-HTR.426是由人工构建的酿酒酵母菌株，其表达的shRNA靶向蚊虫5-羟色胺受体1（5-HTR1）基因中特异性保守的位点。用这种酵母菌饲喂幼蚊，或者通过糖饵（ATSBs）饲喂成蚊，室内试验和室外半现场试验的结果表明，5-HTR. 426菌株的摄入导致伊蚊、按蚊和库蚊幼蚊和成蚊的死亡率显著升高，并导致蚊虫的5-HTR1表达显著降低和严重的神经缺陷，但未发现对非靶标节肢动物产生毒性。5-HTR.426有望实现规模化生产，并在未来的现场试验中进一步评估其作为新型蚊虫控制干预手段的潜力[25]。另一种显示出巨大潜力的RNAi酵母杀虫剂菌株是Sh.463_56.10R，它靶向蚊虫的Shaker基因（编码电压门控钾通道）上的保守序列，在室外半田间试验中，经过灭活和干燥处理的Sh.463_56.10R酵母菌株对埃及伊蚊、白纹伊蚊和致倦库蚊（Cx. pipiens quinquefasciatus）幼虫展现出极高的致死率，在24 h内实现了100%的幼虫死亡。这种酵母菌株可以被混合入热灭活或干燥的制剂中，既可以制成片剂形式，也可以通过与糖饵混合来饲喂成蚊，这种酵母ATSB能够引起伊蚊和库蚊的高发病率[26]。在对埃及伊蚊幼蚊和雌蚊中的Rh转运蛋白基因-1（AeRh50 -1）进行dsRNA介导的RNAi实验后，发现幼蚊马氏管（Malpighian tubules，MT）分泌液中的NH4+水平显著降低，但这不影响整体NH4+运输速率；相对地，雌蚊后肠（hindgut，HG）中的NH4+运输速率则显著降低[27]。
2.1.4 影响免疫系统、病毒传播基因的RNAi通过RNAi技术降低Aedes fluviatilis糖原合酶激酶β（GSK3β）基因的表达，结果不仅发现糖原含量增加，还发现沃尔巴克氏体Wolbachia pipientis种的数量显著上升，表明它在调节宿主体内沃尔巴克氏体共生种群的平衡中发挥着关键作用，该研究首次揭示了GSK3β在Aedes fluviatilis免疫反应中的重要作用[28]。而利用RNAi技术对埃及伊蚊Aag-2细胞内2种可能受到沃尔巴克氏体影响的DENV受体——肌萎缩蛋白聚糖（Dystroglycan）和微管蛋白（Tubulin），进行基因沉默。研究结果表明，沃尔巴克氏体不仅能有效抑制病毒的复制过程，还显著降低了DENV血清型-2（DENV-2）与Aag-2细胞的结合能力，从而影响DENV的传播[29]。RNAi技术也应用于研究蚊虫信号通路的研究。研究人员通过dsRNA介导的RNAi技术，研究了肿瘤坏死因子-α（TNF-α）信号通路中的3个关键基因：Eiger（Eiger作为TNF-α的配体）、Wgn[Wengen（Wgn），TNF-α受体1]和Grnd[Grindelwald（Grnd），TNF-α受体2]在冈比亚按蚊（An. gambiae）中的功能。实验结果显示，这3个基因的沉默显著提高了疟原虫的卵囊数量和感染率，从而证实了它们在按蚊抗疟原虫免疫反应中的重要作用[30]。通过RNAi技术敲减AGO2和vir-1（virus-induced RNA-1）基因[分别是埃及伊蚊RNAi和Janus激酶/信号转导与转录激活子（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）途径的关键基因]后，药物去甲基菊醌B1（demethylasterriquinone B1，DMAQ-B1）和AKT抑制剂Ⅷ介导的抗ZIKV作用显著降低。这表明RNAi和JAK/STAT信号通路在控制埃及伊蚊感染ZIKV中起着关键作用[31]。另外，通过体外和体内RNAi实验，发现组蛋白2A（H2A）能够促进蚊虫对流行性乙型脑炎病毒的感染，这表明蚊虫中的H2A可能在病毒的跨物种传播中起着促进作用[32]。Sanaria® PfSPZ（Plasmodium falciparum sporozoites，疟原虫孢子体）疫苗是一种基于疟原虫孢子体的预防性疫苗，其目的是通过激活人体的免疫系统来预防疟疾感染。这种疫苗是通过无菌培养特定种类的蚊虫（如埃及伊蚊）生产的。埃及伊蚊是能够携带并传递疟原虫的蚊虫种类。通过向这些蚊虫注射dsRNA，能够降低埃及伊蚊中富含亮氨酸重复的免疫分子1（LRIM1）的表达，从而显著提高埃及伊蚊体内PfSPZ的感染率。因此，这种方法不仅提高了疫苗的生产效率，还降低了生产成本，这对于疟疾的控制和消除具有重要意义[33]。
2.2 RNAi应用于蜱蜱是传播原生动物、立克次体和病毒的关键媒介。RNAi技术在蜱研究中的首次应用发生在2002年，当时的研究对象是美洲花蜱（Amblyomma americanum）。在过去20年的研究历程中，研究重点主要集中在蜱的结构和代谢功能相关基因，以及涉及蜱与病原体及宿主相互作用和唾液腺功能的关键基因。通过RNAi技术沉默这些基因的mRNA转录本，可以显著抑制蜱的存活率、生理平衡、繁殖能力以及它们获取和传播病原体的能力[34]。
2.2.1 影响繁殖能力基因的RNAi在对雌性褐黄血蜱（Haemaphysalis flava）进行的RNAi实验中，通过注射2种铁蛋白基因Hf-fer1和Hf-fer2的dsRNA，发现两者的沉默均对蜱的繁殖能力产生了影响。RNAi处理的雌蜱产卵率降低，卵的重量与雌蜱体重的比值减少，出现卵形态异常，且即使形态正常的卵，其孵化能力也低于对照组[35]。对长角血蜱（Ha. longicornis）胚胎发育中的3种关键酶（组织蛋白酶B、组织蛋白酶D和酸性磷酸酶）基因进行RNA干扰后，发现雌蜱的产卵数量并未显著变化，然而卵的孵化率却显著下降[36]。在麻点璃眼蜱（Hyalomma rufipes）中，针对Hr-fer1和Hr-fer2的RNAi实验显著影响了蜱的饱食体重、产卵数量和死亡率，特别是Hr-fer2基因的沉默还显著延长了蜱的进食时间。此外，低温环境下铁蛋白的相对表达水平显著降低，表明HrFer1和HrFer2在蜱对寒冷环境的应激反应中具有调节功能[37]。利用RNAi技术降低2种软蜱Ornithodoros erraticus和O. moubata体内Fer2基因的表达水平，结果在O. moubata中观察到Fer2基因的沉默导致卵孵化率和若虫数量降低。然而，在O. erraticus中，尽管Fer2基因的mRNA表达水平下降了90%，这种变化并未对卵的孵化率和若蜱数量产生影响[38]。RHS8是一种源自镰形扇头蜱（Rhipicephalus haemaphysaloides）的丝氨酸蛋白酶抑制剂，当蜱注射了靶向RHS8基因的双链RNA后，出现了体重减轻、进食时间延长、产卵数量减少以及卵孵化率降低的现象。与对照组相比，RHS8基因沉默的蜱卵巢呈现浅棕色，指示卵黄颗粒的积累减少，从而证实了RHS8在蜱繁殖过程中与卵黄生成密切相关[39]。
2.2.2 影响摄食能力基因的RNAi对长角血蜱的核糖体蛋白S27（RPS-27）进行RNAi后，显著抑制了若蜱及成年雌蜱的摄食能力，并显著降低了若虫的蜕皮成功率。此外，RPS-27基因在卵中的沉默导致了卵的形状和孵化过程出现异常[40]。通过RNAi技术对饱食或遭受巴贝虫（Ba. microti）感染的长角血蜱进行基因功能分析，发现在感染蜱中降低钙网蛋白和卵黄蛋白原2的表达，以及在未感染蜱中降低Obg样腺嘌呤核苷三磷酸酶（ATPase）1的表达，均可加快蜱的饱食过程。相反，在感染蜱中降低卵黄蛋白原1的表达则会导致饱食过程的延迟。在感染蜱中降低钙网蛋白和卵黄蛋白原1的表达，减少了饱食后雌蜱的体重。特别是卵黄蛋白原2的表达降低导致巴贝虫感染水平比对照组下降了51%[41]。对篦子硬蜱（Ixodes ricinus）丝氨酸/苏氨酸激酶AKT基因进行RNA干扰后，影响了蜱的摄食，从而使其产卵的卵群重量减少甚至出现无法产卵的现象[42]。利用RNAi技术沉默镰形扇头蜱中的凋亡抑制蛋白（IAPs），发现RhIAP基因在dsRNA处理后48 h内能被有效抑制，这导致唾液腺出现凋亡迹象，同时抑制了蜱的吸血行为并降低了其饱食率[43]。通过RNAi技术降低篦子硬蜱中的Iripin-8基因表达，可以延长蜱的摄食时间[44]。此外，研究者在钝刺血蜱（Ha. doenitzi）中鉴定出一种新的抗凝血基因，命名为多尼亭-1（Doenitin-1）。这一新基因在钝刺血蜱的吸血过程中发挥作用，并影响其摄食和繁殖。RNAi实验结果表明，Doenitin-1基因的沉默显著降低了钝刺血蜱的饱食率和卵孵化率，暗示Doenitin-1可能成为未来蜱类控制的疫苗候选分子，同时也有可能作为开发新型抗血栓药物的潜在靶点[45]。
2.2.3 影响免疫系统、病毒传播基因的RNAi应用RNAi技术抑制肩突硬蜱（I. scapularis）的脂肪连蛋白受体（ISARL）基因表达，能显著降低蜱携带的伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi，莱姆病的病原体）数量[46]。靶向围食膜几丁质结合蛋白（PM_CBP）基因的RNAi实验结果表明，这种干扰改变了蜱肠道内常驻微生物群落的组成，并影响了伯氏疏螺旋体向小鼠的传播能力[47]，有助于我们找到控制莱姆病传播的新方法。吉氏巴贝虫（Ba. gibsoni）是引起犬巴贝虫病的病原体之一，在长角血蜱感染了吉氏巴贝虫后，应用RNAi技术干扰长角血蜱卵黄原蛋白受体基因的研究发现，特定的寄生虫配体可能与蜱卵母细胞表面的卵黄原蛋白受体结合，使得寄生虫得以侵入卵母细胞，并实现其经卵传播的目的[48]。在美洲花蜱中同工型磷脂酶A2（pAaPLA2_1）经RNAi技术敲减后，导致细菌抑制能力下降，表明pAaPLA2_1在蜱免疫调节反应中可能发挥重要作用[49]。利用RNAi技术沉默长角血蜱中的丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpins），结果显著影响了蜱的摄食行为，并且减少了兰加特病毒（Langat virus，LGTV）从蜱到小鼠的传播。由此可见，抑制Hlserpins的活性能有效阻碍蜱的饱食过程及病原体的传播[50]。对长角血蜱注射丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine-protein kinase，SPK）的dsRNA后，虽然蜱能正常饱血，但观察到表皮颜色变化（可能是由自身免疫反应引起），且这些蜱失去了产卵能力。这表明SPK在蜱的繁殖过程及宿主免疫调节中可能发挥重要作用。此外，注射肌动蛋白解聚因子（ADF）的dsRNA后，蜱无法正常吸血，这表明ADF在促进蜱摄食行为中起着关键作用[51]。通过RNAi技术抑制血红扇头蜱（Rh. haemaphysaloides）的蜕皮激素受体RhEcR基因表达，则能够有效防止蜱唾液腺的退化[52]。
2.3 RNAi应用于淡水螺类 2.3.1 光滑双脐螺（Biomphalaria glabrata）光滑双脐螺是一种淡水螺类，是传播曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）的中间宿主，在水生环境中，特别是在热带和亚热带地区，它们能够通过直接接触人类皮肤，传播人肠道血吸虫病[53]。RNAi技术首次应用于双脐螺，是将纤连蛋白相关蛋白2（FREP2）基因选为RNA干扰的靶标进行敲低。双脐螺在感染吸虫类寄生虫后，FREP2基因的表达通常会上调。通过将直接靶向FREP2基因的dsRNA注入其血淋巴，FREP2的表达水平被显著抑制至对照组的20%~30%。此外，研究者还通过干扰管家基因肌红蛋白的表达，进一步证实了RNAi技术在双脐螺中的可行性。在双脐螺中建立的RNAi技术为揭示宿主-寄生虫相互作用中关键基因的功能提供了一项重要的研究工具[54]。通过向光滑双脐螺注射靶向BgTEP1（一种含硫酯蛋白的寄生虫结合蛋白）的siRNA，观察到其转录本表达下降了70%~80%，同时在血淋巴中分泌的BgTEP1蛋白水平也出现了降低。然而，尽管BgTEP1在RNA和蛋白质水平的表达均有所下调，这种变化并未对螺类与寄生虫之间的相容性造成影响[55]。利用阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）作为载体，研究人员开发了一种通过RNAi技术在螺体内进行非侵入性基因沉默的新方法。即通过PEI介导的浸泡法，在RNA和蛋白质水平上成功实现了过氧化物酶（Prx）的敲低，并通过荧光标记siRNA来评估和优化细胞的递送效率[56]。利用dsRNA对光滑双脐螺中的交替氧化酶（alternative oxidase，AOX）基因进行RNA干扰，使其表达下调，研究发现AOX基因的表达与螺类的生殖发育和产卵行为密切相关。AOX基因的抑制显著阻碍了双脐螺的生长和繁殖过程，特别是在幼螺阶段进行干预时效果尤为显著，这表明AOX是一个控制双脐螺发育和繁殖的潜在靶点[57]。
2.3.2 福寿螺（Pomacea canaliculata）槟榔碱与福寿螺体内的根蛋白样蛋白（PcRoo）高度亲和，能够引起螺鳃部纤毛的脱落，干扰正常的呼吸代谢，并加速其进入血淋巴，同时抑制乙酰胆碱酯酶（AChE），这些作用最终导致福寿螺的死亡。应用RNAi技术降低PcRoo的表达后，经槟榔碱处理的福寿螺中，由于PcRoo的表达量减少，减少了槟榔碱与其的结合，结果使RNAi处理组的死亡率和纤毛脱落率均显著低于对照组[58]。苦葛皂苷A（Pedunsaponin A，PA）的杀螺作用与其对特定蛋白质的靶向作用有关，利用RNAi技术筛选靶标蛋白，鉴定了具有最佳干扰效果的siRNA，发现使用PcAdv处理的福寿螺死亡率为60.0%，显著低于对照组的93.3%；组织学分析显示，鳃结构完整，纤毛脱落减少，血细胞的存活率提高。因此，PcAdv是PA破坏鳃纤毛的关键蛋白。定位在鳃中与药物相互作用的蛋白质并研究其作用机制，对开发新的杀螺剂以控制福寿螺种群具有重要意义[59]。生长激素诱导跨膜蛋白（GHITM）是一种高度保守的跨膜蛋白，通过RNAi实验沉默GHITM基因，揭示GHITM基因可能通过调控Caspase-3活性，发挥抑制细胞凋亡的作用。此外，福寿螺的孔径宽度和体螺长度受到RNAi的显著影响，表明该基因对福寿螺的生长有重要的促进作用[60]。通过应用RNAi技术发现，降低温度使Cldf7和HSP70基因的表达水平升高，这可能是导致四聚乙醛杀螺活性降低的重要原因[61]。
2.4 RNAi应用于螨类鸡皮刺螨（Dermanyssus gallina）被全球公认为是对蛋鸡和种鸡影响最为严重的吸血性外寄生虫。利用RNAi技术对鸡皮刺螨铁蛋白（FERs）基因的功能进行研究，发现Dg-fers在螨虫的生存、繁殖以及消化血液过程中扮演着至关重要的角色[62]。研究者通过向鸡皮刺螨雌性成螨饲喂vATPase亚基A（Dg vATPase A）基因的dsRNA。vATPase是一种质子泵，对于细胞内的酸碱平衡和能量转换非常重要。饲喂Dg vATPase A dsRNA的鸡皮刺螨显示出目标基因表达量的降低[63]。外寄生螨狄斯瓦螨（Varroa destructor）中一个在前腿特异性高表达的转录本Vd40090，编码了一种尼曼-匹克蛋白C2（NPC2），对Vd40090进行dsRNA介导的沉默，有效地破坏了瓦螨对宿主的选择、接受和摄食，并调节与繁殖相关基因的表达，导致繁殖和存活率降低[64]。利用筛选得到的dsHSP70片段，通过浸渍法对粉尘螨（Dermatophagoides farinae）进行了RNAi处理。通过精心设计的浓度梯度实验，发现600 ng/μl的dsHSP70是实现HSP70基因有效沉默的最低浓度。这一结果不仅揭示了HSP70在尘螨热应激反应中的关键调控作用，而且是首次采用非侵入性和高灵敏度的浸渍法对尘螨进行RNA干扰，为医学上具有重要意义的螨类功能基因研究和分子防控策略的开发提供了新的方法[65]。HSC71和HSF是2种热休克蛋白，RNA干扰尘螨的HSC71和HSF基因的表达，结果发现RNA干扰后，2种基因表达量和尘螨存活率均显著降低，说明热休克蛋白赋予了尘螨耐热性或耐寒性[66]。
3 RNAi在实际应用中的挑战尽管在实验室环境中，通过显微注射、饲喂和溶液浸泡等方法进行RNA干扰已经取得了一定的成功，但这些技术在实际应用中仍面临挑战。饲喂是目前最常用的dsRNA递送方法，简便易行，但dsRNA在肠道中可能会受到肠道复杂的消化酶和pH值波动而降解，降低其吸收效率。显微注射技术能够有效地将RNAi分子直接递送到目标组织或血淋巴中，绕过生物屏障如膜结构、唾液和肠道核酸酶，从而防止RNA分子在到达作用位点前被降解[67]。但显微注射主要适用于较大型的害虫，如半翅目昆虫及其卵，对于体型较小的害虫，注射过程可能会导致严重的损伤，影响其生理功能并使实验结果解读变得复杂[67]。另外，显微注射更多地被用于实验室环境中，适用于室内对基因功能的研究，或适用于害虫防治的RNAi靶标基因筛选以及确定dsRNA的有效剂量和干扰效率的关系，而不是直接用于害虫控制。外用给药途径为RNAi技术提供了一种直接有效的递送方法，它包括将dsRNA均匀喷洒在整个虫体表面或通过腹面微注给药的方式实现[68]。这种方法还包括将害虫如埃及伊蚊的蚊蛹直接浸泡在含有dsRNA的溶液中[69]。但由于害虫表皮的天然屏障作用，浸泡法并不适用于所有害虫种类，而是更适合在体外培养的细胞株中实施，例如将果蝇S2细胞株浸泡在含有dsRNA的培养基中以诱导RNA干扰[70]。转染法则是通过特定的转染剂将dsRNA直接传送到细胞内，这种方法相比浸泡法更为高效，尽管它可能涉及额外的成本和潜在的毒性。转染法通常用于那些通过浸泡法难以实现有效RNA干扰的基因的抑制。尽管浸泡法在传递效率上可能低于转染法，但它避免了与转染试剂相关的潜在毒性，使其成为高通量RNAi筛选中的一种经济且安全的选择[70]。因此，选择合适的递送方法对于RNAi技术的成功应用至关重要。需要考虑害虫的大小、生物学特性、实验环境以及RNAi的目标和效率。在选择递送方法时，必须权衡每种方法的优缺点，以确保RNAi分子能够有效地传递并发挥作用，同时使成本和潜在的损伤最小化。
此外，dsRNA的长度、使用剂量或浓度也是影响RNA干扰效率的重要因素。一般适合Dicer酶处理的dsRNA分子长度在50~2 000 bp，最终生成大约长度为21~25个核苷酸的siRNA双链。一般认为，长度为200~550 bp的dsRNA，对触发RNAi效应尤为有效[71]。最新的研究还通过饲喂实验比较了串联dsRNA（C-dsRNAs）与非串联dsRNA（NCL-dsRNA）对RNA干扰效率的影响，发现使用C-dsRNA沉默AChE基因的效果更为显著[72]。可能是因为：C-dsRNA通过串联相同的短dsRNA序列，能够产生一系列特定的靶向siRNA分子，这些分子能够与更多的靶基因mRNA分子结合并促进其降解。相比之下，NCL-dsRNA产生的siRNA种类更多，可能与同一靶基因mRNA的不同区域结合。这意味着，尽管NCL-dsRNA在某些情况下可能有效，但更长的C-dsRNA在实现更高水平的靶基因沉默方面可能更为有效。另外，研究发现，有效诱导RNA干扰效应可能需要较高浓度的dsRNA（> 1 μg/μl），随着dsRNA浓度的增加，害虫的死亡率会逐渐升高[73]，并会在一定的浓度条件下达到死亡率峰值[74]，但频繁使用高剂量的dsRNA可能导致抗性的产生，从而影响RNAi治疗的效果[75]。因此，确定适合RNAi农药长期可持续应用的最佳浓度和剂量，需要进一步的研究和探索。这些发现对于优化RNAi策略，提高害虫控制效率具有重要意义。
为了克服这些限制，研究人员正在探索更为创新和实用的RNAi递送方法。纳米粒子和微生物递送系统因其独特的特性而备受关注。纳米粒子可以保护RNA分子免受降解，同时提供精确的靶向递送能力。而微生物，如经过改造的细菌或病毒，可以作为RNA分子的载体，通过自然途径进入媒介生物体内，从而在不伤害宿主的情况下实现基因沉默。这些新型递送方法不仅提高了RNAi技术的实用性，而且更具有环保性和可持续性。随着这些技术的不断进步和优化，我们有理由相信，RNAi技术将在未来媒介生物控制策略中发挥更加重要的作用，为减少疾病传播和保护公共卫生做出贡献[13]。
4 总结与展望RNAi技术的发展经历了从最初的发现到机制研究和应用拓展的过程，已经成为一种重要的广泛应用于动物、植物和微生物的基因调控和治疗工具[76]。利用RNAi技术作为反向遗传工具，通过合成siRNA[77]或使用基因表达载体来产生dsRNA[78]，可选择性靶向特定基因进行沉默，从而研究该基因的功能和作用机制。在基因治疗和害虫控制方面，通过抑制与疾病相关或对害虫生存至关重要的基因，RNAi技术展现出了巨大的潜力。随着技术的进步，RNAi方法也在不断改进。例如，通过化学修饰dsRNA，可以增强其稳定性和特异性，从而提高RNAi的效果[79-80]。此外，借助纳米技术和靶向递送系统[81]，可以将siRNA精准地送达到特定的细胞或组织，进一步提升RNA干扰的效率和安全性。
总的来说，RNAi技术在媒介生物防治领域展现出巨大的应用潜力。通过利用RNAi技术沉默媒介生物中的关键基因，可以有效地控制媒介生物的数量和扩散。然而，在将该技术应用于媒介生物防治之前，我们仍需进一步研究以解决RNAi技术在实际应用中可能遇到的挑战，包括对非靶标生物的潜在影响、dsRNA在环境中的稳定性、适宜的剂量、有效的给药方法和频繁高剂量的dsRNA可能导致抗性的产生等，以实现其可持续和有效的应用。无可否认，基于RNAi技术的防治策略为提高媒介生物控制的有效性和靶向性提供了新的机遇[75]。
利益冲突 无
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