海南自由贸易港气候独特^[1]，区位优势明显，口岸地区出入境货物流动大、人员活动频繁，媒介生物传染病的传入传出风险较高^[2]。其中小型兽类（小兽）可携带并传播包括鼠疫、巴尔通体病、钩端螺旋体病、肾综合征出血热等近90种疾病^[3]，是多种自然疫源性疾病的重要储存宿主，是重要的病媒生物防控对象^[4]，海南境内口岸地区小兽的监测和控制在保障出入境旅客身体健康、防止媒介生物传染病传播等方面占有重要的地位。目前海南省小兽监测研究较少^[5]，未见对海南省当地小兽情况的系统性阐述，不能对当地小兽情况及病原体情况进行宏观把控及针对性防控。在小兽监测中，传统方法虽具备成本低廉、操作简便的优点，但无法摆脱对专业人员的要求及对环境的限制，经过监测技术的完善与创新，动态、系统、连续、准确、可持续监测小兽情况的智能方法，为小兽及鼠源疾病防控提供了科学基础及新的研究思路。为提高当地对鼠传疾病的预防及控制，根据《全国病媒生物病原学监测方案（试行）》（中疾控传发〔2020〕13号）的相关要求，本研究于2023年8－9月采用智能与传统监测相结合的方法对海南境内5个口岸小兽进行初步调查及携带病原体的检测，以期了解当地小兽的种类构成及携带病原体情况，为当地鼠源性疾病的风险评估提供基础数据，为海南省的灭鼠防病工作提供科学依据。

2023年8－9月，采用笼夜法（传统笼与智能笼结合应用）于海南三亚机场（三亚）、博鳌机场（博鳌）、海口港、马村港和洋浦港5个口岸的机场货站、绿化带、居民区等监测点进行小兽监测，每5 m布放1只鼠笼，行间距不少于50 m，传统笼与智能笼交替布放，晚放晨收，将捕获的小兽装入布袋，带回实验室，麻醉后采用颈椎脱臼法处死，根据形态学进行种类鉴定，记录性别、种类、捕获环境等相关信息，然后解剖取小兽肝、肾、肺、胰组织，保存于-80 ℃超低温冰箱中备用。

式中，有效笼数=布笼数－无效笼数，无效笼指丢失或不明原因击发的笼子。

以捕获率来表示小兽的种群密度。笼夜法小兽密度参考控制标准为捕获率 < 0.5%。优势种判断标准：捕获数量构成比 > 10%为优势种，构成比1%~10%为常见种，< 1%为偶见种^[6]。

将肝、肾、肺、胰等组织各20 mg放入1.5 ml的离心管中，加入缓冲液，充分研磨后，分成2部分分别提取DNA和RNA。提取试剂分别采用DNeasy Blood & Tissue Kit（QIAGEN）试剂盒和RNeasy Blood & Tissue Kit（QIAGEN）试剂盒，具体步骤参见试剂盒说明书。用PCR方法检测肝、肾、肺、胰组织的巴尔通体^[7]（Bartonella）、鼠疫耶尔森菌^[8]（Yersinia pestis）、伯氏疏螺旋体^[9]（Borrelia burgdorferi）、钩端螺旋体^[10]（Leptospira），用巢氏PCR方法检测肝、肾、肺、胰组织嗜吞噬细胞无形体^[11]（Anaplasma phagocytophilum）、恙虫病东方体^[12]（Orientia tsutsugamushi）和博卡病毒^[13]（Bocavirus），用巢氏反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）方法检测肺组织的汉坦病毒（Hantavirus）^[8]。

DNeasy Blood & Tissue Kit（QIAGEN）试剂盒和RNeasy Blood & Tissue Kit（QIAGEN）试剂盒购自凯杰生物技术（上海）有限公司，普通PCR仪购自杭州柏恒科技有限公司，电泳仪购自北京君意东方电泳设备有限公司。

引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，各病原体核酸检测引物序列见表 1。

表 1 小兽携带病原体PCR/巢氏PCR检测所用引物序列 Table 1 Primer sequences used for the detection of pathogens carried by small mammals

表选项

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。所获序列在美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库中采用基于局部比对算法的搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）进行同源性比对。用MEGA Ⅹ软件计算碱基组成，采用邻接法（neighbor-joining method，NJ法）构建系统发育树。

采用SPSS 27.0软件进行统计分析，率和构成比的组间比较采用χ²检验或Fisher确切概率法，双侧P < 0.05为差异有统计学意义。

本次调查期间共布放鼠笼830个，回收有效鼠笼754个，共捕获小兽2科3属5种43只，总捕获率为5.70%。其中臭鼩（Suncus murinus）和黄胸鼠（Rattus tanezumi）为优势种，分别占60.46%和20.93%；褐家鼠（R. norvegicus）（9.30%）、黄毛鼠（R. losea）（6.98%）和小家鼠（Mus musculus）（2.33%）为常见种。捕获的43只小兽中，雌性18只，雄性25只，雌雄比例为1∶1.39。小兽体表未采集到蜱、螨、蚤等体表寄生虫。

本次调查5个口岸中，三亚机场与海口港口岸小兽密度最高，分别为12.86%和10.00%，其次是洋浦港与博鳌机场，小兽密度分别为6.25%和3.23%，马村港口岸捕获最低，仅0.91%。不同口岸间小兽密度差异有统计学意义（χ² =23.748，P < 0.001）。三亚机场区域优势种为臭鼩和小家鼠；海口和洋浦港口岸区域优势种均为臭鼩、黄胸鼠和黄毛鼠；褐家鼠和黄胸鼠为博鳌口岸区域优势种；马村港口岸仅臭鼩占优势。各口岸间不同种类小兽构成比差异有统计学意义（χ² =24.734，P=0.013）。见表 2。

表 2 2023年8－9月海南5个口岸地区小兽捕获率及种类构成 Table 2 Capture rates and species composition of small mammals in five port areas in Hainan Province during August and September 2023

表选项

本次调查期间共回收有效鼠笼754个，其中传统笼499个、智能笼255个。其中，传统笼捕获率6.21%，智能笼数捕获率4.71%，二者捕获率相近。传统笼与智能笼的捕获率差异无统计学意义（χ²=0.712，P=0.399）。见表 3。

表 3 海南5个口岸小兽捕获情况 Table 3 Captured small mammals in five port areas in Hainan Province

表选项

对小兽肝、肾、肺、胰等组织进行8种病原体检测，共在5只小兽中检出5种病原体，总病原体阳性率为11.63%（5/43），其中汉坦病毒2株（黄胸鼠和褐家鼠各1株，均捕获于海口港）、钩端螺旋体2株（黄胸鼠和褐家鼠各1株）、巴尔通体1株（黄胸鼠）、博卡病毒1株（褐家鼠）和嗜吞噬细胞无形体1株（黄胸鼠）。将PCR扩增信号较强的产物进行测序，结果进行BLAST分析，2株汉坦病毒分离株的序列相似性为99.74%，显示与GenBank中Orthohantavirus seoulense分离株GZRn53（MN022824.1）的包膜糖蛋白基因相似性达97.96%~98.18%；1株巴尔通体分离株与Bartonella sp. RT242YN（FJ589057.1）的柠檬酸合酶（gltA）基因相似性达99.71%；2株钩端螺旋体分离株的序列相似性为97.21%，与未培养的Leptospira sp.克隆Xianning82（OP875004.1）的前蛋白转位酶亚基SecY基因相似性达97.60%~99.60%；1株博卡病毒分离株与Porcine bocavirus病毒株YN.27（MG365886.1）的相似性达99.47%；1株嗜吞噬细胞无形体分离株与Anaplasma phagocytophilum分离株ZJAEAA-4（KU586068.1）的16S rRNA基因基因相似性达92.95%，与未培养的Candidatus Neoehrlichia sp.克隆SC-21-366（OP493163.1）的16S rRNA基因相似性达96.88%。其中汉坦病毒（均为汉城型）和钩端螺旋体阳性率均为4.65%（2/43）；巴尔通体、博卡病毒和嗜吞噬细胞无形体阳性率均为2.33%（1/43）。4只褐家鼠中2只检出病原体核酸阳性，9只黄胸鼠中检出3只病原体核酸阳性，臭鼩、黄毛鼠和小家鼠中8种病原体均未检出。见表 4。

表 4 2023年8－9月海南5个口岸小型兽类携带病原体情况 Table 4 Pathogens carried by small mammals in five port areas in Hainan Province during August and September 2023

表选项

此外，在1只褐家鼠和1只黄胸鼠中分别检出多种病原体，均在海口口岸捕获，其中1份雄性褐家鼠标本中同时检测出汉城病毒和博卡病毒，1份雄性黄胸鼠标本中同时检测出汉城病毒和钩端螺旋体。

将2株汉坦病毒进行同源性分析，2株同源性一致，与我国发现的首尔病毒（Seoul Hantavirus，SEOV）亲缘关系较近，见图 1；1株博卡病毒与我国发现的Bocaparvovirus sp.属于同一进化分支，见图 2；1株嗜吞噬细胞无形体与我国浙江发现的Ehrlichia sp.位于同一进化分支，亲缘关系较近，见图 3；2株钩端螺旋体和斯里兰卡发现的Leptospira interrogans位于同一进化分支，与我国发现的Leptospira sp.进化距离较远，见图 4；1株巴尔通体与泰国东北部印鼠客蚤（Xenopsylla cheopis）中发现的B. tribocorum位于同一进化分支，亲缘关系较近，见图 5。

注：●为本次检测到的汉坦病毒序列。 图 1 2023年8－9月海南口岸地区小型兽类中检出的汉坦病毒同源性分析 Figure 1 Homology analysis of Hantavirus in small mammals in port areas in Hainan Province during August and September 2023

图选项

注：●为本次检测到的博卡病毒序列。 图 2 2023年8－9月海南口岸地区小型兽类中检出的博卡病毒同源性分析 Figure 2 Homology analysis of Bocavirus in small mammals in port areas in Hainan Province during August and September 2023

图选项

注：●为本次检测到的嗜吞噬细胞无形体序列。 图 3 2023年8－9月海南口岸地区小型兽类中检出的嗜吞噬细胞无形体同源性分析 Figure 3 Homology analysis of Anaplasma phagocytophilum in small mammals in port areas in Hainan Province during August and September 2023

图选项

注：●为本次检测到的钩端螺旋体序列。 图 4 2023年8－9月海南口岸地区小型兽类中检出的钩端螺旋体同源性分析 Figure 4 Homology analysis of Leptospira in small mammals in port areas in Hainan Province during August and September 2023

图选项

注：●为本次检测到的巴尔通体序列。 图 5 2023年8－9月海南口岸地区小型兽类中检出的巴尔通体同源性分析 Figure 5 Homology analysis of Bartonella in small mammals in port areas in Hainan Province during August and September 2023

图选项

除本次调查的海南5口岸进行小兽监测外，哈尔滨海关漠河口岸、乌鲁木齐海关霍尔果斯口岸也进行类似调查。漠河口岸进行小兽密度监测并对采集到的样本开展斑点热群立克次体（spotted fever group Rickettsia，SFGR）、鼠疫耶尔森菌、伯氏疏螺旋体等病原体检测；霍尔果斯口岸开展小兽密度监测及检测汉坦病毒、嗜吞噬细胞无形体、莱姆病螺旋体、鼠疫耶尔森菌、斑点热群立克次体。

除海南5个口岸使用笼夜法外，漠河与霍尔果斯口岸均使用夹夜法或夹日法；捕鼠器械布放数量上，漠河口岸的布放数和有效布放数均最高，霍尔果斯口岸居中，海南口岸最低，其中霍尔果斯口岸的捕鼠器械回收率最低，漠河的最高，海南居中；小兽捕获数量上，漠河口岸最高，霍尔果斯次之，海南最低，但捕获密度方面，霍尔果斯口岸最高，海南次之，漠河最低；漠河口岸以黑线姬鼠（Apodemus agrarius）、朝鲜姬鼠（A. peninsulae）、小家鼠为优势种，霍尔果斯口岸以小林姬鼠（A. sylvaticus）、大沙鼠（Rhombomys opimus）、小家鼠为优势种，海南口岸以臭鼩、黄胸鼠为主，3地差异明显；霍尔果斯与海南口岸捕获小兽雌雄比例接近；病原体检出种类数及阳性率漠河、海南、霍尔果斯3地依次递减，其中漠河阳性率达50.48%，漠河与海南口岸检出病原体种类数相近，但汉坦病毒分型不同，霍尔果斯口岸检出病原体种类数最低，3地均有嗜吞噬细胞无形体检出；漠河与海南口岸均存在同一小兽分离到多种病原体情况，其中漠河口岸分离到的病原体以SFGR为主，海南口岸以汉城病毒为主；测序结果显示3地病原体间无明显联系。见表 5。

表 5 漠河口岸、霍尔果斯口岸和海南5口岸小兽监测情况对比 Table 5 Comparison of the monitoring data of small mammals between the Mohe Port, the Khorgos Port, and the five ports in Hainan Province

表选项

相较于2019年鼠类监测报告^[16]中的全国小兽总密度0.60%~1.00%和海南省小兽总密度2.00%，本次监测海南口岸小兽密度（5.70%）明显较高，可能与本次监测区域为海南口岸地区，且监测时间正处于全年鼠密度高峰期有关。全国鼠类报告中显示全国范围内，以褐家鼠、小家鼠和黄胸鼠捕获最多、分布最广^[16-17]；海南省范围内，以褐家鼠与食虫目鼩鼱科最多，未捕获到小家鼠、黄胸鼠^[16]。而此次海南口岸以黄胸鼠和臭鼩为优势种，各口岸间小兽总密度差异有统计学意义，其中三亚机场和海口港口岸最高，洋浦港和博鳌口岸次之，马村港最低。这可能与三亚机场和海口港口岸区域人口较为稠密、小兽食物充足等因素有关。各口岸间不同种类小兽构成比差异有统计学意义，如三亚机场口岸优势种为臭鼩和小家鼠；海口港和洋浦港优势种均为臭鼩、黄胸鼠、黄毛鼠；褐家鼠和黄胸鼠为博鳌口岸优势种；马村港仅臭鼩占优势。海南省近年来仅在海口市^[18]、三沙市^{[5, 19]}等地有小兽监测情况报道，其中，2017年海口市捕获小兽以褐家鼠、黄胸鼠为主^[18]，2016－2019年在海南口岸调查结果以褐家鼠为优势种^[20]，本次调查褐家鼠占比低，可能与监测时间以及监测点设置区域有关。本次监测点设置于海南多个口岸区域，附近多有水流、部分地点荒草丛生，垃圾遍地，周边环境复杂，有人为投放鼠夹及小兽药痕迹，均会对小兽捕获产生影响，故本次调查存在一定局限性，不能完全代表当地小兽情况，仍需进一步监测。

在捕获工具方面，传统笼与智能笼的总捕获率以及不同监测口岸间的捕获率、捕获小兽的物种组成和雌雄构成等均无统计学意义，符合设计要求；在性能方面，智能笼拥有区别于传统笼的报警装置和监测系统，能及时有效地对捕获地点进行定位，方便工作人员及时对鼠笼进行更换，提高捕获效率。但智能监测设备红外装置之间灵敏度有强弱区别，可能与芯片不稳定有关，存在蜗牛、蚂蚁等小型动物易触发红外感应引起误报情况。

在国境口岸地区病媒生物常规监测工作中，需实行简便快速、高灵敏度、适用范围广泛的方法，且本次监测的主要目的是为了解海南多个口岸小兽的种群组成及其携带病原体情况，故本研究未进行病原体的分离或者培养，而是采用了检测较为迅速的PCR及RT-PCR法检测了汉坦病毒、巴尔通体、钩端螺旋体等8种常见的鼠传病原体。结果显示海南口岸小兽汉坦病毒、巴尔通体、钩端螺旋体、博卡病毒和嗜吞噬细胞无形体等5种病原体均有阳性检出，且存在同一标本分离到2种病原体的现象。2021年全国病媒生物鼠传病原监测报告^[17]中病原体阳性率分别为汉坦病毒2.43%、钩端螺旋体5.75%、恙虫病东方体0.05%、巴尔通体2.39%和嗜吞噬细胞无形体0.04%，相比之下，本次海南口岸监测汉坦病毒（4.65%）和嗜吞噬细胞无形体（2.33%）阳性率较高，钩端螺旋体（4.65%）相对较低，且有博卡病毒检出。本次调查得出不同种类小兽的病原体总携带率（阳性率）差异有统计学意义，其中仅在黄胸鼠、褐家鼠中检出病原体且阳性率较高，与监测报告中一致^[17]，需要对褐家鼠和黄胸鼠开展长期监测和控制。但不同种类小兽的汉坦病毒、巴尔通体等5种病原体携带率差异均无统计学意义，故控制黄胸鼠和褐家鼠密度虽可从一定程度上降低鼠传疾病的发生率，但不能精准控制某一种鼠传疾病。不同口岸捕获、不同性别的小兽病原体总感染率、汉坦病毒、巴尔通体等5种病原体携带率差异无统计学意义，即感染这5种病原体的小兽在海南口岸地区均匀分布，为预防相应的鼠传疾病，需对各口岸全面开展小兽密度控制。

汉坦病毒在宿主动物中一般不致病^[21]。在人类中可引起2种疾病，分别为肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）和汉坦病毒心肺综合征（Hantavirus cardiopulmonary syndrome，HCPS）^[22]。我国是世界上HFRS累计病例最多的国家^[21]，在一定条件下海南省局部地区有可能发生HFRS暴发^[23]。本次调查检出汉坦病毒阳性小兽2例，核酸分型均为汉城型，其阳性率为4.65%，高于海南省三沙市（2.33%）^[24]，低于2016－2019年海南口岸调查的11.67%^[20]。在本次调查中占比60.47%的臭鼩，无汉坦病毒阳性检出，与现有研究结果不一致^[25]，仍需捕获一定数量的臭鼩进一步研究。汉坦病毒阳性样本主要涉及褐家鼠和黄胸鼠，均捕获于海口港监测区域，海口港阳性率高达11.11%（2/18），当地需加强对褐家鼠和黄胸鼠的控制及对HFRS的防制。

本次调查海南口岸小兽中巴尔通体总阳性率2.33%，低于以往报道（9.2%）^[26]。本次调查仅在海口港捕获的黄胸鼠中检测出巴尔通体，与既往报道相似^[27]。在博鳌口岸、海口港均有钩端螺旋体阳性检出，应周期性开展灭鼠防鼠、环境整治，降低环境中存在的致病因子。

博卡病毒是近几年被发现的一种哺乳动物共感染的新型DNA病毒^[28]。曾在澄迈县的褐家鼠体内检出^[29]，本次调查中位于澄迈县的马村港口岸捕获的臭鼩体内未检出，而海口港捕获的褐家鼠中有阳性检出，与我国南方地区研究结果一致^[30]，褐家鼠可能为博卡病毒常见宿主。嗜吞噬细胞无形体是一种经蜱传播的病原体，可侵染人和动物的中性粒细胞而引起无形体病^[31]。本次调查在洋浦港捕获的黄胸鼠中有阳性检出，提示需加强局部地区蜱、蚊等节肢动物控制。

中国西部最大的边境陆路口岸——霍尔果斯口岸、联通俄罗斯和远东地区的资源战略大通道——漠河口岸和自由贸易港——海南岛，3个地区的口岸设立都具有重大的时代意义，承担着重大的历史责任，除关注经济贸易和旅游事业以外，口岸小兽及其携带病原体的监测也不容忽视。

海南自然资源丰富，湿润温暖，适宜食虫目鼩鼱科的生存，鼩鼱能消灭一部分害虫，对农林有利，而霍尔果斯和漠河口岸均以鼠科姬鼠属为主要优势种，姬鼠属形大体长，除危害农林外，还是肾综合征出血热、钩端螺旋体病、森林脑炎等多种疾病的传播者，两地需加强姬鼠密度及携带病原体监测；海南与漠河口岸监测检出病原体种类数相近，但汉坦病毒分型有明显差异，海南口岸主要从家栖鼠体内检测到汉城病毒，漠河口岸主要从野外的姬鼠属体内检测到汉滩病毒；两地均存在同一小兽分离到多种病原体情况，但病原体种类不同，这种“多病原”的检出是否会增加单个病原体的传播力及毒力，需补充当地居民或医院相关疾病发生情况资料后，进一步研究佐证；3地均有嗜吞噬细胞无形体检出，嗜吞噬细胞无形体以蜱虫叮咬传播为主，3地需加强蜱等节肢媒介生物控制，做好环境治理工作。但3地小兽监测、病原体检测方法不完全相同，且捕获结果可能受鼠的种类或所选捕鼠工具与鼠体大小不适合影响捕获数量等因素影响，所以检测结果可能存在较大差异，需要进一步研究。

根据本次监测结果，发现海南口岸区域小兽种类多且密度不低，同时携带多种自然疫源性疾病的病原体，其中感染汉坦病毒、博卡病毒和嗜吞噬细胞无形体菌株为国内流行株，钩端螺旋体和巴尔通体应为外来菌株，提示当地可能存在相关疾病流行，对当地人群及出入境旅客身体健康构成潜在威胁。本次调查所捕获的小兽数量、物种有限，在结果外推时存在一定的局限性，故仍需进一步捕获一定数量的小兽进行病原体检测，增强结果说服力。在口岸区域范围内，需进行环境有效治理，做到日常保持环境卫生，防鼠灭鼠设施常检常修，进行环境有效治理，将环境治理、物理防治和化学防治有机结合^[32]，粘鼠板、鼠夹、鼠笼结合应用，同时进行毒饵诱杀，尤其是在灭鼠的最佳时期冬季开展大面积灭鼠活动^[33]，可在小兽繁殖高峰来临前将密度降低，降低鼠源疾病的发生风险^[34]。在包括口岸地区在内的海南省积极开展小兽携带病原体的本底调查，对防控海南自由贸易港新发、再发传染病具有重要的公共卫生学意义。

利益冲突  无