鼠源疾病是一类由啮齿动物作为传染源或传播媒介传播引起的严重影响人类健康的重要传染病^[1-2]。啮齿动物可携带200多种病原体，至少能引起84种人兽共患疾病，病死率高^[2-3]。近年来，随着人类活动增强，啮齿动物栖息地和活动区域不断扩大，增加了人类感染鼠传自然疫源性病原体的风险^{[2, 4-5]}。有效监测鼠传病原体在啮齿动物中的感染情况，有助于预防和控制鼠源疾病的发生和传播^[2]。

《全国病媒生物病原学监测方案（试行）》（中疾控传发〔2020〕13号）将土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis，Ft）、巴尔通体（Bartonella spp.，Bar）、问号钩端螺旋体（Leptospira interrogans，Lep）、地方性斑疹伤寒立克次体（Rickettsia typhi，Rt）、嗜吞噬细胞无形体（Anaplasma phagocytophilum，Ap）及恙虫病东方体（Orientia tsutsugamushi，Ot）6种鼠传病原体纳入监测范围。其中Ft是潜在的细菌生物战剂，可引起土拉热^[6]；Bar和Ap可分别引起巴尔通体病和人粒细胞无形体病^[4]；Lep和Rt可分别引起我国的法定乙类传染病钩端螺旋体病和法定丙类传染病地方性斑疹伤寒^[7-9]；而Ot则可引起恙虫病^[10]。这些传染病在我国均有报道，传播速度快、危害性大，对公共卫生安全可造成严重影响。

目前，实验室常使用单重实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）方法检测Ft、Ot、Bar、Lep、Rt和Ap 6种鼠传病原体，其具有特异性强、敏感性高和重复性好的优点^{[4, 6, 11-14]}，但该方法仅可针对1种病原体进行检测，不仅费时费力，还会造成试剂和耗材的浪费^[15]。因此，构建多重qPCR方法对于鼠传病原体的快速检测具有积极意义。Lep和Bar是较为常见的2种鼠传病原体，在啮齿动物中常常出现复合感染的情况^[16-17]，此外，也有研究报道了啮齿动物Ap和Rt复合感染现象^[18]。在啮齿动物携带病原体的实际监测工作中，涉及这6种鼠传病原体的三重及以上的多重感染情况较为少见^{[4, 19-20]}；同时考虑到多重反应体系涉及多对引物和探针时，往往会出现引物间、引物与探针间的交叉干扰现象^[18]。因此本研究采用3种双重qPCR反应体系分别检测Ft和Ot、Bar和Lep、Rt和Ap 6种病原体，为快速、高效检测鼠传病原体提供参考，也对鼠源疾病预防及监测提供技术支持。

1 材料与方法 1.1 引物和探针合成

查阅相关文献^[4]，选择Ft、Bar、Lep、Rt、Ap和Ot 6种鼠传病原体的qPCR特异性引物及探针，并通过Thermo Fisher公司的在线工具Multiple Primer Analyzer评估，选择出引物退火温度相接近，且不形成引物二聚体和发卡结构的病原体组合，再对探针5′端的荧光基团以及3′端的猝灭基团进行调整，形成3种体系，命名为A、B、C体系，分别用于检测Ft和Ot、Bar和Lep、Rt和Ap，见表 1。引物和探针均委托北京擎科生物科技股份有限公司合成。用无菌水将引物和探针稀释成浓度为10 μmol/L的工作液，-20 ℃保存备用。

1.2 阳性质粒制备

6种鼠传病原体靶标序列的重组质粒标准品由北京擎科生物科技股份有限公司合成。测定质粒的浓度，计算其拷贝数，并按照10倍梯度稀释，获得1×10⁰~1×10⁶拷贝/μl的阳性质控品。拷贝数（拷贝/L）=质粒浓度×10^-9×6.02×10²³/（660×质粒碱基数）。

1.3 双重qPCR方法建立

使用Taq pro HS universal U⁺ probe master mix试剂盒（货号：QN114-01，生产厂家：南京诺唯赞生物科技股份有限公司）进行qPCR反应。本研究共建立3种双重qPCR反应体系，反应总体积均为20 μl，包括质粒模板3 μl，2× Taq pro HS universal U⁺ probe master mix 10 μl，正、反向引物各0.4 μl，探针0.2 μl，无菌水补齐。质粒均按照1∶1混合。置于CFX96荧光定量PCR仪（美国BIO-RED公司）分别对其引物和探针的浓度和退火温度进行优化。引物设置4个梯度，加入不同体积的引物使其终浓度分别为0.1、0.2、0.3和0.4 μmol/L，引物和探针体积比始终保持2∶1。反应程序：37 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，退火温度分别设为50、54、56、58和60 ℃，30 s，共45次循环。

1.4 建立标准曲线

在优化的qPCR反应条件下，以无菌水为阴性对照，选取1×10²~1×10⁶拷贝/μl 5个稀释浓度的混合阳性质控品为模板进行qPCR反应，得到循环阈值（cycle threshold，Ct值）。以质粒拷贝数的对数值（lg）为横坐标，Ct值为纵坐标，制作标准曲线。

1.5 敏感性检测

选择1×10⁰~1×10³拷贝/μl的混合阳性质控品为模板，以无菌水为阴性对照，按照优化的反应条件进行扩增反应，以评价建立方法的敏感性。每稀释度分别做3次平行实验，每实验重复3次。

1.6 特异性检测

用优化的反应条件检测大肠埃希菌（Escherichia coli）、布鲁氏菌（Brucella）以及除目的病原体外的其他4种鼠传病原体的阳性质粒，以目的病原体阳性质粒为阳性对照，无菌水为阴性对照，以评价建立方法的特异性。

1.7 重复性检测

以1×10³~1×10⁵拷贝/μl的混合阳性质控品为模板，无菌水为阴性对照，进行qPCR反应，每个稀释度重复3次。根据获得的Ct值，分别计算平均值、标准差以及变异系数，评价建立方法的重复性。

1.8 鼠组织核酸模拟标本制备

准备4份来自健康小白鼠的组织标本。每份按体积比约2∶1∶1∶1的比例剪取肺、肝、脾和肾组织25~30 mg置于装有200 μl磷酸盐缓冲液（PBS）溶液和20~30粒研磨珠的研磨管中，加入20 μl 6种鼠传病原体的等体积混合的阳性质粒，均匀振荡30 s后应用RZ-Gr96高通量研磨仪（北京国科融智生物公司）进行机械研磨，程序设置为“1 600 r/min研磨30 s，暂停10 s，共3次”。短暂离心（相对离心力约为850 g），吸取上层组织液，使用病毒DNA/RNA提取试剂盒（4.0）（西安天隆科技有限公司，货号：T035）提取核酸。

1.9 多重实时荧光qPCR方法的应用

使用单重qPCR和建立的双重qPCR方法对来自某两省的10份阳性标本（5份Lep阳性、4份Bar阳性以及1份Lep和Bar混合感染阳性标本），以及本研究构建的4份鼠组织核酸模拟标本同时进行检测，并以6种鼠传病原体的等体积混合阳性质粒为阳性对照，无菌水为阴性对照，以评估建立方法的适用性。阳性结果判断标准^[4]：Rt，Ct≤36；Bar，Ct≤35；Lep，Ct≤35；Ot，Ct≤33；Ap，Ct≤35；Ft，Ct≤36。

2 结果 2.1 反应条件及程序的优化

选择Ct值较小、荧光强度高、曲线光滑、扩增效率接近100%的反应条件作为最后的优化结果。优化后反应体系包括模板3 μl，2× Taq pro HS universal U⁺ probe master mix 10 μl，正、反向引物各0.4 μl，探针0.2 μl，加无菌水补充至20 μl；反应程序为：37 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，45次循环。

2.2 标准曲线绘制

以1×10²~1×10⁶拷贝/μl的混合阳性质控品为模板，进行双重qPCR反应，同时绘制标准曲线。结果显示，各质粒拷贝数的lg值与Ct间存在良好的线性关系，见图 1。在A体系中，Ft和Ot的标准曲线方程分别为y=-3.449lg（x）+40.386，R²=0.988；y=-3.587lg（x）+41.251，R²=0.990。在B体系中，Bar和Lep的标准曲线方程分别为y=-3.757lg（x）+41.235，R²=0.998；y=-3.935lg（x）+43.495，R²=0.997。在C体系中，Rt、Ap的标准曲线方程分别为y=-3.537lg（x）+40.461，R²=0.999；y=-3.469lg（x）+40.267，R²=0.996。

2.3 敏感性检测结果

分别以1×10⁰~1×10³拷贝/μl的混合阳性质控品为模板，利用优化后的双重qPCR方法进行扩增。结果显示，各体系中的鼠传病原体混合质粒的检测下限均为1×10¹拷贝/μl，见表 2。所建立的多重qPCR敏感性较好。

2.4 特异性检测结果

使用建立的双重qPCR方法对大肠埃希菌、布鲁氏菌、本研究中除目的病原体外的4种鼠传病原体的阳性质粒进行扩增。结果显示，A体系中只有Ft和Ot、B体系中只有Bar和Lep、C体系中只有Rt和Ap的混合阳性质粒出现明显的特异性扩增曲线，其他病原体质粒和阴性对照均未出现荧光信号，见图 2。所建立的方法特异性较强。

2.5 重复性检测结果

以1×10³~1×10⁵拷贝/μl的混合阳性质控品为模板，每一稀释度重复3次。结果显示，6种鼠传病原体的组内变异系数为0.04%~1.20%，阴性对照均无Ct值，见表 3。所建立的方法重复性较好。

2.6 双重qPCR检测感染标本

应用建立的双重qPCR方法检测鼠组织核酸模拟标本和某两省阳性标本。结果显示，在鼠组织核酸模拟标本中，通过A、B、C 3种体系检测，均观察到核酸模拟标本和阳性对照中Ft和Ot、Bar和Lep、Rt和Ap明显的扩增曲线，而阴性对照未出现扩增现象，见图 3。此外，某两省阳性标本的双重qPCR检测结果与单重qPCR检测结果一致，见表 4。所建立的双重qPCR方法可行性和准确性良好。

3 讨论

qPCR方法与传统微生物检测方法，如分离培养、生化鉴定和血清学鉴定相比，具有检测速度快、灵敏度高、特异性强以及检测通量高等显著优势，被广泛应用于病原体的检测、定性和定量分析^[21-24]。特别是多重qPCR方法，可同时检测多种病原体，这不仅减少了试剂和耗材的消耗，还大大节约了实验时间，缩短了检测周期^[25]。鉴于此，许多研究者都相继开始建立多种病原体的多重qPCR检测方法，如利用多重qPCR方法快速检测食物中的副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和沙门菌（Salmonella）^[26]，鼠标本中的伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）、弓形虫（Toxplasma gondii）和恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）^[27]，以及肉制品中的沙门菌、单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）和大肠埃希菌O157∶H7^[28]。

本研究在前人的基础上^{[4, 6, 10-14]}，成功优化了这3种双重qPCR方法分别用于检测Ot和Ft、Rt和Ap、Bar和Lep。在建立的方法中，对6种病原体的最低检出限均为1×10¹拷贝/μl，其中Rt的最低检出限与早期杨晓等^[11]建立的Rt TaqMan-MGB qPCR方法的敏感性一致，Ap的最低检出限与张晶波等^[12]建立的Ap TaqMan-MGB qPCR方法敏感性一致，Ot的最低检出限与付秀萍等^[13]建立的Ot TaqMan-MGB qPCR方法敏感性一致，Lep的最低检出限与张翠彩等^[14]建立的钩端螺旋体TaqMan qPCR方法敏感性一致，Ft的最低检出限与史清海等^[6]建立的Ft TaqMan qPCR方法敏感性一致，Bar的最低检出限与栗冬梅等^[4]评估的Bar TaqMan qPCR方法敏感性一致。此外，进行重复性和特异性实验，结果表明构建的双重qPCR方法Ct值变异系数均 < 2%，重复性好，并且具有特异性强、无交叉反应等优点。通过检测鼠组织核酸模拟标本和某两省阳性感染标本，验证了建立方法的可靠性。综上所述，本研究建立的3种双重qPCR方法敏感性高、重复性好、特异性强，可广泛应用于Ot、Ft、Rt、Ap、Bar和Lep 6种鼠传病原体的快速检测，在疾病控制现场和临床等领域具有很好的应用前景。

利益冲突  无