白纹伊蚊（Aedes albopictus）是我国常见蚊种之一，分布范围广泛，南至高温多雨的热带海南省，北至温带气候的辽宁省等地^[1-2]，是传播登革热、黄热病、西尼罗病毒病、寨卡病毒病和基孔肯雅热等多种传染病的媒介^[3]。白纹伊蚊在辽宁省活动期主要为6－9月，既往在沈阳、大连、营口和朝阳市都曾监测到。近年来，我国多省均出现登革热疫情暴发或流行^[4-6]。登革热目前尚无有效疫苗预防和特效的治疗手段，使用化学杀虫剂大规模杀灭成蚊和幼蚊是登革热疫情防控的有效应对措施。拟除虫菊酯类杀虫剂因具有广谱、低毒、高效等优点，在过去的30年来，被广泛应用于防蚊灭蚊工作，随着杀虫剂长期、大量使用，导致蚊虫产生不同程度的抗药性，给登革热等虫媒传染病防控增加了难度^[7-9]。

拟除虫菊酯类杀虫剂的主要靶标位点为电压门控钠离子通道（voltage-gated sodium channel，VGSC），由VGSC基因编码，该基因突变导致编码的氨基酸发生改变，从而降低其对杀虫剂的敏感度，产生击倒抗性（knockdown resistance，kdr）^[10-11]。目前击倒抗性研究主要集中在VGSC基因的第Ⅱ、Ⅲ跨膜结构域，主要包括1016、1532和1534等3个位点突变情况。本次调查采集辽宁省大连和营口市白纹伊蚊野外种群，检测其对3种拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性情况，并用分子生物学手段检测分析VGSC基因突变情况，初步探索其对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性水平及发展趋势，以期为抗药性的分子作用机制研究提供基础数据。

2023年7－8月，从辽宁省大连和营口市人居环境采集白纹伊蚊成蚊400只和幼蚊3 000条，将采获试虫在饲养室饲养，给成蚊提供5%葡糖糖水，雌蚊用小白鼠供血，经形态学方法鉴定为白纹伊蚊，饲养至F1代选择羽化后3~5 d的未吸血健康雌蚊进行成蚊抗药性测定。随机选取110只白纹伊蚊雌蚊作为击倒抗性基因检测试虫，用75%乙醇溶液浸泡，并于-20 ℃冻存备用。

成蚊选用0.4%氯菊酯、0.03%溴氰菊酯、0.08%高效氯氰菊酯3种药膜纸和空白对照，均由中国疾病预防控制中心（疾控中心）传染病预防控制所（传染病所）媒介生物控制室统一提供。动物组织DNA提取试剂盒（磁珠法微量组织基因组DNA提取试剂盒Ⅱ，规格型号：AU19014，批号：B012007023），购自北京百泰克生物技术有限公司，2×Taq PCR预混液购自北京全式金生物技术有限公司，引物由北京德奥平生物技术有限公司合成。

采用成蚊接触筒法^[12]。蚊虫种群抗性水平判断依据诊断剂量下蚊虫的死亡率（GB/T 26347－2010）：98%≤死亡率≤100%为敏感种群，80%≤死亡率 < 98%死亡率为可能抗性种群，死亡率 < 80%为抗性种群。

经形态学方法鉴定为白纹伊蚊的110只雌蚊样本，按照试剂盒说明书提取单只蚊虫基因组DNA。以基因组DNA为模板扩增VGSC基因的第Ⅱ、Ⅲ跨膜结构域的部分基因片段，采用Kasai等^[13-14]的研究合成引物。第Ⅱ跨膜结构域扩增引物为正向aegSCF20：5′-GACAATGTG GATCGCTTCCC-3′，反向aegSCR21：5′-GCAATC TGGCTTGTTAACTTG-3′。PCR反应体系为25 μl，包含2×Taq PCR预混液12.5 μl，10 μmol/L正、反向引物各1 μl，DNA模版2 μl，加双蒸水补至25 μl。PCR反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 8 min，4 ℃保存。第Ⅲ跨膜结构域扩增引物为正向aegSCF7：5′-GAGAACTCGCCGATGAACTT-3′，反向aegSCF7：5′-GACGACGAAATCGAACAGGT-3′。PCR反应体系与第Ⅱ跨膜结构域基因扩增相同。PCR反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 8 min，4 ℃保存。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，将出现目的片段大小且条带清晰无拖尾的PCR产物送至北京德奥平生物技术有限公司进行测序。第Ⅱ、Ⅲ跨膜结构域对应的测序引物为aegSCR22：5′-TTCACGAACTTGAGCGCGTTG-3′和aegSCR8：5′-TAGCTTTCAGCGGCTTCTTC-3′。

运用Excel 2010软件记录整理实验数据，用SeqMan、MEGA 7.0软件进行序列比对和峰图分析，观察1016、1532和1534位点突变情况，确定白纹伊蚊野外种群的等位基因类型和基因型，计算VGSC基因的等位基因和基因型的频率分布。

依据中国疾控中心传染病所媒介生物控制室建立的白纹伊蚊成蚊抗药性诊断剂量，测定3种拟除虫菊酯类杀虫剂对白纹伊蚊24 h的死亡率，见表 1。结果表明，大连种群对氯菊酯、溴氰菊酯、高效氯氰菊酯均产生可能抗性，营口种群对氯菊酯、溴氰菊酯、高效氯氰菊酯均已产生抗性。

表 1 辽宁省2个白纹伊蚊野外种群抗药性测定结果 Table 1 Results of insecticide resistance of two field Aedes albopictus populations in Liaoning Province, China

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对110份白纹伊蚊DNA样本进行反向测序检测，获得220条DNA序列，测序片段长度约为400 bp，在GenBank上进行比对，结果与白纹伊蚊VGSC基因第Ⅱ、Ⅲ编码区的部分序列一致性达99.00%，对获得的220条序列比对分析发现，白纹伊蚊在1016、1532和1534位点均存在一定程度的突变，碱基改变导致相应的氨基酸替换。1016位点存在GTA到GGA的突变，导致缬氨酸V被甘氨酸G替换；1532位点存在ATC到ACC的突变，导致异亮氨酸I被苏氨酸T替换；1534位点突变最为丰富多样，TTC突变成TCC、TGC和CTC，导致苯丙氨酸F被丝氨酸S、半胱氨酸C或亮氨酸L替换。1016、1532和1534位点共有14种基因型，各个位点的基因型密码子图谱见图 1。

注：红色峰形代表胸腺嘧啶（T），绿色峰形代表腺嘌呤（A），蓝色峰形代表胞嘧啶（C），黑色峰形代表鸟嘌呤（G）；双峰代表单核苷酸多态性（SNP）位点，会导致密码子多态性。 图 1 辽宁省白纹伊蚊VGSC基因1016、1532和1534位点基因型测序峰图 Figure 1 Genotype sequencing chromatogram at 1016, 1532, and 1534 loci of VGSC gene of Aedes albopictus in Liaoning Province, China

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1016和1532位点以野生型纯合子为主，野生/突变型杂合子次之，突变型纯合子所占比例最低。1534基因位点以野生/突变型杂合子为主，野生型纯合子和突变型纯合子次之，突变型杂合子最低。1016位点有2种等位基因，有3种基因型。1532位点有2种等位基因，有3种基因型。1534位点有4种等位基因，有8种基因型。大连种群以1534位点突变为主，其次是1016位点，1532位点突变频率最低。营口种群以1534位点突变为主，且突变的基因型丰富多样，存在F/S、F/C、F/L、S/S、C/C、L/L和S/C 7种类型，其次是1532位点，1016位点突变基因型频率最低，仅为7.27%。不同种群不同位点的等位基因型、个体基因型及频率分布，见表 2、3。

表 2 辽宁省白纹伊蚊VGSC基因不同位点的个体等位基因及频率分布 Table 2 Allele type and frequency distribution of different VGSC gene loci of individual Aedes albopictus in Liaoning Province, China

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表 3 辽宁省白纹伊蚊VGSC基因不同位点的个体基因型及频率分布 Table 3 Genotype and frequency distribution of different VGSC gene loci of individual Aedes albopictus in Liaoning Province, China

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测序110只白纹伊蚊样本中，获得20种基因型组合，其中检测到VGSC基因部分片段1016、1532和1534位点均为野生型纯合子的有2个（1.82%），仅出现在大连种群。1016、1532和1534位点突变组合丰富多样，1个位点为突变型的个体有71个（64.54%），2个位点为突变型的个体有37个（33.64%）。所有突变基因型组合中，V/G+I/I+F/S基因型组合频率最高（16.36%），其次为V/V+I/I+F/L基因型（12.73%），最低为V/V+I/T+F/L基因型（0.91%），仅在营口种群中出现1个个体，未检测到1016、1532和1534同时突变的个体。见表 4。

表 4 辽宁省白纹伊蚊VGSC基因1016、1532和1534位点基因型组合频率分布 Table 4 Frequency distribution of genotype combinations at 1016, 1532, and 1534 loci of VGSC gene of Aedes albopictus in Liaoning Province, China

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白纹伊蚊是登革热等多种蚊媒传染病的传播媒介，科学、准确地监测其抗药性水平是防控的前提和基础^[15]。辽宁省既往登革热疫情均由非洲、美洲、东南亚及我国南方等流行地区输入，尚未监测到本地传播。本次调查采集大连和营口市白纹伊蚊野外种群，采用生物测定和分子生物学2种方法进行抗药性判断，其中白纹伊蚊对杀虫剂分子抗性为辽宁省首次监测。生物测定结果显示，大连种群对氯菊酯、溴氰菊酯、高效氯氰菊酯已产生可能抗性，2017年大连种群对以上3种杀虫剂均为敏感群体^[16]；营口种群对氯菊酯、溴氰菊酯、高效氯氰菊酯均已产生抗性，可能与近年来大量、连续使用拟除虫菊酯类杀虫剂，导致蚊虫的抗药性问题日渐严重有关，应尽快采取有效措施，调整杀虫剂的用药方案。

本研究发现，辽宁省2个白纹伊蚊野外种群VGSC基因的1016、1532和1534位点均存在突变，其中1016位点突变频率为31.82%（35/110），高于四川省内江市和北京市的研究结果^[17-18]，1016位点突变是2019年在白纹伊蚊中新发现的突变位点，有研究表明1016位点与1534位点突变相比具有更高的拟除虫菊酯类杀虫剂抗性水平^{[14, 19]}。1532位点突变频率为24.55%（27/110），高于四川省内江市和江苏省的研究结果^{[17, 20]}，1532位点有2种等位基因，即野生型ATC/I和突变型ACC/T，I1532T突变等位基因在抗药性中的作用尚无定论，有文献报道VGSC基因I1532T突变使白纹伊蚊对氯菊酯敏感性下降，但与溴氰菊酯敏感性无相关性^[21]。1534位点较1016和I1532位点突变更为频繁，且种类丰富多样，发现S/C/L共3种有义突变，突变频率为75.45%（83/110），低于四川省内江市和云南省景洪市的研究结果^[22]。

本研究获得的2个白纹伊蚊野外种群1534位点突变类型和突变率不完全相同，大连种群以突变型1534S为主，营口种群以1534C和1534L为主，这可能与该地区使用的杀虫剂类型、频次和剂量等因素相关。本次调查共发现20种基因型组合，朱彩英^[23]2018－2019年对中国12个种群共407份白纹伊蚊样本检测得到19种基因型组合，本研究中单位点突变频率为64.54%，双位点突变频率为33.64%，未发现3个位点同时突变的个体，3个位点均为野生型纯合子的仅有2个，占1.82%。所有突变基因型组合中，V/G+I/I+F/S基因型组合频率最高（16.36%），其次为V/V+I/I+F/L基因型（12.73%），最低为V/V+I/T+F/L基因型（0.91%），这可能是多种杀虫剂长期作用的结果。以上结果显示，该地区白纹伊蚊已对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗药性，今后应减少拟除虫菊酯类杀虫剂的使用，以延缓杀虫剂抗药性的发展，保障蚊虫的杀灭效果。

本研究作为辽宁省白纹伊蚊野外种群对杀虫剂分子抗性检测的初步探索，存在一定的局限性，生物测定法与分子生物学测定法分开检测，未能用同一批白纹伊蚊样本进行处理。在后续的监测中将尽可能对同批次标本同时进行白纹伊蚊生物测定和VGSC基因多位点的检测，以便更全面地掌握白纹伊蚊抗药性情况和开发检测抗药性分子标志，提升病媒生物抗药性监测工作的质量和效率。

利益冲突  无