2025, Vol. 36
表1(Table 1)
北京市顺义区白纹伊蚊Brevihamaparvovirus属病毒的分离与鉴定
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文章信息
- 许秀燕, 阎婷, 李静, 朱思捷, 张洪江, 周小洁, 佟颖, 张勇
- XU Xiu-yan, YAN Ting, LI Jing, ZHU Si-jie, ZHANG Hong-jiang, ZHOU Xiao-jie, TONG Ying, ZHANG Yong
- 北京市顺义区白纹伊蚊Brevihamaparvovirus属病毒的分离与鉴定
- Isolation and identification of Aedes albopictus Densovirus (Brevihamaparvovirus) in Shunyi District, Beijing, China
- 中国媒介生物学及控制杂志, 2025, 36(1): 4-10
- Chin J Vector Biol & Control, 2025, 36(1): 4-10
- 10.11853/j.issn.1003.8280.2025.01.002
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文章历史
- 收稿日期: 2024-03-26
许秀燕, 阎婷, 李静, 朱思捷, 张洪江, 周小洁, 佟颖, 张勇. 北京市顺义区白纹伊蚊Brevihamaparvovirus属病毒的分离与鉴定[J]. 中国媒介生物学及控制杂志, 2025, 36(1): 4-10.
XU Xiu-yan, YAN Ting, LI Jing, ZHU Si-jie, ZHANG Hong-jiang, ZHOU Xiao-jie, TONG Ying, ZHANG Yong. Isolation and identification of Aedes albopictus Densovirus (Brevihamaparvovirus) in Shunyi District, Beijing, China[J]. Chin J Vector Biol & Control, 2025, 36(1): 4-10.
北京市顺义区白纹伊蚊Brevihamaparvovirus属病毒的分离与鉴定
1 北京市疾病预防控制中心消毒与有害生物防制所, 北京 100013;
2 北京市顺义区疾病预防控制中心, 北京 101300
2 北京市顺义区疾病预防控制中心, 北京 101300
摘要: 目的 对2021年北京市顺义区采集的白纹伊蚊标本进行病毒分离和鉴定。方法 将蚊虫研磨液平行接种叙利亚仓鼠肾细胞（BHK-21细胞）和白纹伊蚊卵细胞（C6/36细胞）进行病毒分离，对病毒分离物开展分子生物学鉴定。结果 2021年在北京市顺义区野外采集的白纹伊蚊标本中分离到1株可以引起C6/36细胞病变的病毒分离物（AalDV-8）。病毒基因组编码区核苷酸序列的分析结果显示，AalDV-8病毒为单链DNA病毒，该病毒基因组编码区全长为3 335 nt，共编码2个非结构蛋白（NS1、NS2）和1个衣壳蛋白（VP），3种蛋白的核苷酸（氨基酸）序列长度分别为2 376 nt（791 aa）、1 092 nt（363 aa）、1 071 nt（356 aa）。经病毒系统进化分析发现，AalDV-8病毒位于Brevihamaparvovirus属病毒进化组，并与中国广州市白纹伊蚊中分离的AalDV-7病毒亲缘关系最近。结论 首次从北京市白纹伊蚊野外种群中分离出Brevihamaparvovirus属病毒。
关键词:
细小病毒 Brevihamaparvovirus属 白纹伊蚊
Isolation and identification of Aedes albopictus Densovirus (Brevihamaparvovirus) in Shunyi District, Beijing, China
1 Institute of Disinfection and Vector Control, Beijing Center for Disease Prevention and Control, Beijing 100013, China;
2 Beijing Shunyi District Center for Disease Prevention and Control, Beijing 101300, China
2 Beijing Shunyi District Center for Disease Prevention and Control, Beijing 101300, China
Abstract: Objective To isolate and identify viruses in Aedes albopictus specimens from Shunyi District, Beijing, China in 2021. Methods The virus was isolated by parallel inoculation of Syrian hamster kidney cell line BHK-21 and Ae. albopictus C6/36 cells with mosquito grinding liquid, and molecular biological identification was carried out for the virus isolates. Results A virus isolate (AalDV-8) was isolated from Ae. albopictus specimens collected from the field in Shunyi District, Beijing in 2021, which could cause C6/36 cell lesion. The nucleotide sequence analysis of the virus genome coding region showed that AalDV-8 virus was a single-stranded DNA virus with a total length of 3 335 nt, encoding 2 non-structural proteins (NS1 and NS2) and 1 capsid protein (VP). The nucleotide (amino acid) sequence lengths of the three proteins were 2 376 nt (791 aa), 1 092 nt (363 aa), and 1 071 nt (356 aa), respectively. The phylogenetic analysis showed that AalDV-8 virus belonged to Brevihamaparvovirus group and was closely related to AalDV-7 virus isolated from Ae. albopictus in Guangzhou, China. Conclusion This is the first time to isolate Brevihamaparvovirus from the field Ae. albopictus collected from in Beijing.
Key words:
Parvovirus Brevihamaparvovirus Aedes albopictus
细小病毒是一种无包膜、二十面体形状的单链线性DNA病毒，基因组全长约4~6 kb核苷酸[1]。依据国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）2019年发布的最新病毒学分类报告，细小病毒科（Parvoviridae）分为浓核病毒亚科（Densovirinae）、Hamaparvovirinae亚科和细小病毒亚科（Parvovirinae）3个亚科。新建立的Hamaparvovirinae亚科病毒可以感染脊椎动物和无脊椎动物，包含5个病毒属，分别为Brevihamaparvovirus、Hepanhamaparvovirus、Penstylhamaparvovirus、Ichthamaparvovirus和Chaphamaparvovirus 5个属，其中Brevihamaparvovirus、Hepanhamaparvovirus和Penstylhamaparvovirus病毒属分别包含原浓核病毒亚科中的Brevidensovirus、Hepandensovirus、Penstyldensovirus病毒属[2]。
Brevihamaparvovirus属细小病毒包括3个成员，分别是Brevihamaparvovirus dipteran1、Brevihamaparvovirus dipteran2和Brevihamaparvovirus orthopteran1。Brevihamaparvovirus属病毒具有3个开放阅读框，编码两种非结构蛋白（NS1，NS2）和衣壳蛋白（VP）[3]。目前，Brevihamaparvovirus属病毒仅从蚊虫细胞系和野生蚊虫中分离得到，其宿主特异性强，仅感染蚊类，实验证实其不能感染其他种类昆虫、鱼类、鸟类和包括人类在内的哺乳动物[4-5]。Brevihamaparvovirus属病毒分布广泛，主要来自亚洲[6]、美洲[7]、欧洲[8]和非洲[9]不同种类的伊蚊（Aedes）和库蚊（Culex）。
我国辽宁、云南、贵州、陕西、广东省和新疆维吾尔自治区不同种类的库蚊和伊蚊中均分离出Brevihamaparvovirus属病毒[10]。本研究于2021年6－9月在北京市采集的白纹伊蚊（Ae. albopictus）标本中鉴定出1株Brevihamaparvovirus属病毒。该病毒是全世界范围内在白纹伊蚊的体内或者白纹伊蚊卵细胞（C6/36细胞）系内分离得到的第8株Brevihamaparvovirus属病毒，根据ICTV颁布的病毒分类命名规则将该株病毒命名为Ae. albopictus Densovirus 8（AalDV-8），也是北京市首次从蚊虫野外种群中分离出的Brevihamaparvovirus属病毒。
1 材料与方法 1.1 标本采集2021年6－9月在北京市顺义区的居民区、公园和机场周边采用二氧化碳诱蚊灯法采集蚊虫标本，每月采集1次，共采集4次，采集时间为日落前1 h至次日日出后1 h。将采集的蚊虫活标本放入-20 ℃冰箱中30 min后取出，在冰浴条件下进行标本分类鉴定，并根据采集时间、采集环境等信息进行分装和编号登记。标本放入液氮中保存直至实验室检测[11-12]。
1.2 细胞叙利亚仓鼠肾细胞（BHK-21细胞）和C6/36细胞为本实验室保存。BHK-21细胞培养条件：92%最低必须培养基（minimum essential medium，MEM）（Corning-cellgro，默克生命科学）、7%胎牛血清（Gibco，赛默飞世尔科技公司）、1%青霉素和链霉素（北京雷根生物技术有限公司）；C6/36细胞培养条件：89% RPMI 1640培养基（Gibco，赛默飞世尔科技公司）、10%胎牛血清（Gibco，赛默飞世尔科技公司）、1%的青霉素和链霉素（北京雷根生物技术有限公司）。BHK-21和C6/36细胞分别置于含5% CO2的37 ℃培养箱、28 ℃培养箱中培养[13]。
1.3 病毒分离每30只蚊虫为1批，加入1.5 ml研磨液（99%MEM、1%青霉素和链霉素），使用研磨器研磨至标本完全破碎。研磨后离心（4 ℃，13 200 g，30 min），离心后取上清100 µl分别接种到生长至80%的单层BHK-21细胞和C6/36细胞24孔培养板中。接种后的BHK-21细胞和C6/36细胞分别置于含5% CO2的37 ℃和28 ℃条件下连续培养。每12 h在显微镜下观察细胞病变（CPE），细胞出现CPE时收取病毒液保存于-80 ℃超低温冰箱直至进一步鉴定[14]。
1.4 DNA提取按照DNeasy® Blood & Tissue Kit试剂盒（Qiagen）说明书操作步骤提取标本研磨上清的DNA。提取的DNA可立即使用或置于-40 ℃保存备用，并用于后续DNA病毒的检测。
1.5 病毒RNA提取及cDNA文库制备按照Viral RNA Mini Kit试剂盒（Qiagen）的说明书操作步骤提取标本研磨上清的总RNA。提取的总RNA放入65 ℃水浴10 min，然后立即冰浴2 min，取32 μl RNA加入到Ready-To-Go kit试剂盒（GE Healthcare）中的第一链反应管，室温静置1 min，加入1 µl随机引物[pd（N）6]后瞬时离心，37 ℃水浴60 min。如此制备的病毒RNA的cDNA文库总体积为33 µl，可立即使用或置于-40 ℃保存备用，并可用于后续RNA病毒的检测。
1.6 病毒基因扩增与核苷酸序列测定病毒基因扩增体系为25 µl，包括：cDNA模板、GoTaq® Green Master Mix，2×（Promega，Madison，WI）、10 μmol/L的正、反向引物。使用黄病毒属（Flavivirus）引物和甲病毒属（Alphavirus）引物进行半巢式PCR扩增，使用西藏环状病毒（Tibet orbivirus）、盖塔病毒（Getah virus）、辽宁病毒（Liaoning virus）、版纳病毒（Banna virus）、OYA病毒（Oya virus）、Brevihamaparvovirus属病毒特异性引物进行PCR扩增，引物序列见表 1，Brevihamaparvovirus属病毒全基因组编码区序列扩增引物序列见表 2。PCR反应结束后，取5 µl基因扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。基因扩增阳性产物开展核苷酸序列测定[15]。
表 1 蚊虫体内病毒PCR扩增所用引物序列
Table 1 Sequence of primers used for polymerase chain reaction amplification of mosquito viruses
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表 2 Brevihamaparvovirus属病毒全基因组编码区序列扩增引物序列
Table 2 Sequence of primers for amplification of whole genome coding region of Brevihamaparvovirus
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将获得的核苷酸序列在美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站使用基于局部比对算法的搜索工具（BLAST）进行序列比对。使用SeqMan软件进行核苷酸序列拼接与质量分析；使用BioEdit 7.0.5.3软件进行核苷酸多序列比对；使用MEGA 6.0软件完成基于邻接（neighbour-joining，NJ）法的系统进化分析，bootstrap值设定为1 000[16-17]。
2 结果 2.1 标本采集共采集到白纹伊蚊1 950只，其中在居民区、公园和机场周边分别采集390、330和1 230只。
2.2 病毒初步鉴定将采集的1 950只白纹伊蚊标本分65批研磨处理，每批次30只蚊虫。PCR扩增结果显示，65批白纹伊蚊标本中仅有1批标本（B44株）Brevihamaparvovirus属病毒基因扩增阳性，命名为AalDV-8病毒。B44株的采集地点为机场周边，其他白纹伊蚊标本中均未发现病毒阳性扩增条带。
2.3 病毒分离将Brevihamaparvovirus属病毒基因扩增阳性株B44的研磨上清接种C6/36细胞和BHK-21细胞连续培养，每12 h在光学显微镜下观察细胞是否发生病变。结果表明B44株仅在C6/36细胞发生病变，在接种C6/36细胞第4天出现细胞病变，表现为细胞聚集、脱落等，并可在C6/36细胞中稳定传代，见图 1。
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| 图 1 AalDV-8病毒分离物接种白纹伊蚊C6/36细胞病变图 Figure 1 Lesions of Aedes albopictus C6/36 cells inoculated with the virus isolate AalDV-8 |
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AalDV-8病毒使用Brevihamaparvovirus属病毒特异性引物进行PCR基因扩增获得约593 bp的特异性扩增产物，序列测定后，通过BLAST比对，与Ae. albopictus Densovirus 7（MK182384.1）同源性 > 98%，提示AalDV-8病毒为Brevihamaparvovirus属病毒。
根据Ae. albopictus Densovirus 7的病毒基因组序列信息，通过Primer-BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast）设计出可以覆盖全基因组编码区核苷酸序列的扩增引物，见表 2。以B44株的研磨上清所提取的DNA为模板，使用所设计的引物对AalDV-8病毒基因组编码区序列进行PCR扩增与核苷酸序列测定，并对获得的核苷酸序列进行拼接，最终获得基因组编码区全序列信息。AalDV-8病毒的基因组编码区核苷酸和氨基酸序列已上传至GenBank，登录号为OQ878960。
对AalDV-8病毒基因组编码区核苷酸序列的分析结果显示，AalDV-8病毒为单链DNA病毒，该病毒基因组编码区全长为3 335 nt，共编码2个非结构蛋白（NS1、NS2）和1个衣壳蛋白（VP），3种蛋白的核苷酸（氨基酸）序列长度分别为2 376 nt（791 aa）、1 092 nt（363 aa）、1 071 nt（356 aa）。AalDV-8病毒基因组结构见图 2。
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| 注：AalDV-8按照5′-3′编码NS1、NS2、VP蛋白。 图 2 AalDV-8病毒基因组结构图 Figure 2 Genome structure of AalDV-8 virus |
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制备系统进化分析数据集，使用NJ法构建系统进化树进行系统进化分析，结果显示，Brevihamaparvovirus属病毒可分为2个进化支，第1个进化分支由Ae. albopictus Densovirus 2、Ae. albopictus Densovirus 5、Ae. albopictus Densovirus 7、AalDV-8、Ae. aegypti Densovirus 1、Ae. aegypti Densovirus 2、Cx. pipiens pallens Densovirus、Anopheles gambiae Densovirus组成，大多数从蚊虫中分离而来；第2个进化分支由Ae. albopictus Densovirus 1、Ae. albopictus Densovirus 3、Haemagogus equinus Densovirus组成，主要从实验室细胞系中分离出，AalDV-8病毒位于Brevihamaparvovirus属病毒进化组中的第1个进化分支，并与中国广州市白纹伊蚊中分离的Ae. albopictus Densovirus 7病毒亲缘关系最近。见图 3~6。
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| 注：图为Hamaparvovirinae亚科病毒全基因的完整核苷酸序列构建的系统进化树，所用数据集为Brevihamaparvovirus属所有病毒及Hamaparvovirinae亚科其他4个属代表株病毒的全基因完整核苷酸序列；各分支基因序列信息排列方式为“检索号/病毒名称/分离株/分离地/分离时间/宿主”；▲表示本研究所获北京市白纹伊蚊分离株AalDV-8。 图 3 AalDV-8病毒的全基因系统进化分析 Figure 3 Phylogenetic analysis of the whole genome of AalDV-8 virus |
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| 注：图为Brevihamaparvovirus属病毒的非结构蛋白NS1基因的完整核苷酸序列构建的系统进化树；各分支基因序列信息排列方式为“检索号/病毒名称/分离株/分离地/分离时间/宿主”；▲表示本研究所获北京市白纹伊蚊分离株AalDV-8。 图 4 AalDV-8病毒的非结构蛋白NS1基因系统进化分析 Figure 4 Phylogenetic analysis of non-structural protein NS1 gene AalDV-8 virus |
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| 注：图为Brevihamaparvovirus属病毒的非结构蛋白NS2基因的完整核苷酸序列构建的系统进化树；各分支基因序列信息排列方式为“检索号/病毒名称/分离株/分离地/分离时间/宿主”；▲表示本研究所获北京市白纹伊蚊分离株AalDV-8。 图 5 AalDV-8病毒的非结构蛋白NS2基因系统进化分析 Figure 5 Phylogenetic analysis of non-structural protein NS2 gene of AalDV-8 virus |
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| 注：图为Brevihamaparvovirus属病毒衣壳蛋白（VP）基因的完整核苷酸序列构建的系统进化树；各分支基因序列信息排方式为“检索号/病毒名称/分离株/分离地/分离时间/宿主”；▲表示本研究所获北京市白纹伊蚊分离株AalDV-8。 图 6 AalDV-8病毒的衣壳蛋白（VP）基因系统进化分析 Figure 6 Phylogenetic analysis of capsid protein (VP) gene of AalDV-8 virus |
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在过去10年中，除了发现许多与嗜血节肢动物相关的致病病毒外，许多研究还揭示了大量所谓的昆虫特异性病毒（insect-specific viruses，ISV），这些病毒在脊椎动物细胞中都具有受限/零复制能力[18]，其中就包括Brevihamaparvovirus属的病毒[19]。
在白纹伊蚊体内或者白纹伊蚊C6/36细胞系内已分离到7株Brevihamaparvovirus属病毒，AalDV-1~AalDV-4分别分离自美国[20]、广州[21]、秘鲁[22]和泰国[23]的C6/36细胞系，AalDV-5[22]、AalDV-6[24]和AalDV-7[22]分离自广州市白纹伊蚊野外种群，本研究于2021年6－9月在北京市采集的白纹伊蚊标本中分离获得的AalDV-8病毒是由白纹伊蚊分离得到的第8株病毒，这是首次从北京市蚊虫野外种群中分离出Brevihamaparvovirus属病毒。
截止目前，Brevihamaparvovirus病毒属病毒仅从蚊虫细胞系和野生蚊虫中分离得到，属于蚊虫特异性病毒[4-5]，特异性感染蚊类，可以在自然界中垂直和水平传播，高滴度病毒可以直接杀伤蚊类，低滴度可以影响蚊类寿命、产卵量、孵化率等，从而降低蚊虫种群数量[22]。目前多种Brevihamaparvovirus属病毒的全基因组已经成功构建为感染性克隆质粒载体，便于进行基因改造使其成为优良的基因转移载体和基因表达载体[22]。有研究以Ae. aegypti Densovirus为载体，表达东亚钳蝎（Buthus martensii）特异性神经毒素Bm KIT，增强病毒的杀伤效果，因而可通过基因工程方法有效增加野生型Ae. aegypti Densovirus的毒性，成为生物杀虫剂或者基因表达载体[25]。有研究表明，广州白纹伊蚊分离的Ae. albopictus Densovirus 7病毒有望成为生物杀虫剂或者基因表达载体，本研究分离的AalDV-8病毒与Ae. albopictus Densovirus 7病毒具有相同的病毒基因组结构和基因组长度。系统进化分析结果显示，无论病毒全基因组序列，还是NS1、NS2和VP基因，AalDV-8病毒与此前分离的Ae. albopictus Densovirus 7病毒亲缘关系最近，均处在共同的进化分支。因此，对AalDV-8病毒进行分离和鉴定，分析其分子生物学和病原性特点，探索AalDV-8病毒作为生物杀虫剂和基因表达载体的可能性，可为发展生物杀虫剂提供更多可替代的选择。
利益冲突 无
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