钩端螺旋体病（leptospirosis，钩体病）是一种由致病性钩端螺旋体（Leptospira，钩体）引起的人兽共患传染病，常见于热带及亚热带地区，在动物和人群中广泛传播，小兽是钩体的最主要的储存宿主^[1]。该病在20世纪60年代中期至70年代末期是舟山市常见的人兽共患传染病，且时有局部暴发流行，最严重的一起暴发，患者多达234例。随着舟山市防治水平、社会环境、经济发展与人民生活水平的提高，自1982年以后未见该病的报道^[2]。21世纪以来全国钩体发病率、死亡率呈逐步下降态势，近10年已处于较低水平，但局部地区仍然有小范围的流行与暴发^[3-4]。2022年4月20日舟山医院确诊1例钩体患者^[5]，2023年9月普陀医院又确诊1例^[2]，2例病例均居住于普陀区展茅社区，相互距离500 m内。钩体病例的陆续出现提示相关区域存在该病的流行风险，为此定海区疾病预防控制中心（疾控中心）在毗邻普陀区展茅街道的定海区白泉镇展开主要宿主动物与常住居民的钩体感染情况专题调查，通过对主要宿主动物、传染源与居民感染状况的调查结果来评估当前钩体病在定海区域的潜在流行风险，为今后舟山海岛地区钩体病防控与早期诊断提供依据。

白泉镇位于舟山市本岛中心位置，三面环山一面向海，东经112°10'13' '，北纬30°10'5' '。全镇下辖1个社区14个行政村，总人口38 207人。耕地面积14.78 km²，林地面积39.40 km²，镇内有1家中型生猪屠宰场。居民多居住于山脚与平原的接壤处，主要从事果蔬菜、水稻、苗木种植以及水产养殖等。鼠种分布主要为褐家鼠（Rattus norvegicus）、小家鼠（Mus musculus）等。

监测时间与地点参照《全国病媒生物病原学监测方案（试行）》^[6]，自2023年1月起至2023年12月止，监测点覆盖全镇15个社区（村）。采用夹夜法和笼夜法在农田、果园、林地、荒地、居民区等生境中捕获小兽，记录动物种类、捕获位置和环境等信息，无菌操作采集小兽肾脏组织超低温保存待检；经知情同意后，采集白泉镇常住居民静脉血分离血清后置于-80 ℃保存用于钩体核酸、IgG与IgM检测。

核酸提取试剂购自QIAGEN公司（货号74104），One Step PrimeScript^TMRT-PCR Kit（Perfect Real Time）（货号RR064A）、PrimeScript^TM One Step RT-PCR Kit Ver.2（货号RR057A）购自TaKaRa公司，钩体IgM、IgG抗体酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂购自德国维润赛润公司（批号EM0233/EM0232）。实时荧光定量PCR仪（ABI公司V7型）、普通PCR仪（德国Jena公司，型号Tone 96G）、高速离心机（美国贝克曼公司，型号Microfuge16）、电泳仪及电泳槽（上海天能科技有限公司，型号EPS-300）、酶标仪（奥地利TECAN公司，型号Sunrise）、生物安全柜（苏净安泰空气技术有限公司，型号BSC1000）。

小兽肾脏组织与人群血清核酸检测选用王蓉等^[7]报道的反转录实时荧光定量PCR（quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR），钩体核酸检测循环阈值（cycle threshold value，Ct） < 20为强阳性，20~ < 30为阳性，30~35为弱阳性，Ct > 35或无Ct值为阴性。

人群血清采用ELISA检测钩体IgM与IgG。IgM待检血清预处理：样本稀释液800 µl+类风湿吸附剂200 µl+待检血清10 µl混合，室温15 min；IgG待检血清预处理：样本稀释液1 000 µl+待检血清10 µl混合。取预处理血清、阴性、阳性对照血清各100 µl分别加入到相对应的反应孔中37 ℃孵育1 h，洗涤甩干后加酶标工作液100 µl 37 ℃孵育30 min，洗涤甩干加显色液100 µl 37 ℃孵育30 min再加终止液100 µl后在酶标仪上测定吸光度（A）值。A值≥临界值为阳性，A值< 临界值为阴性。IgM阳性或IgM与IgG双阳性提示为近期感染，IgG单项阳性提示为既往感染。

无菌解剖小兽活体，取双肾脏组织。1份肾脏组织用于钩体核酸检测，另1份用于钩体分离培养。钩体病原分离培养方法参照中华人民共和国卫生部标准（WS 290－2008）^[8]。具体操作：取新鲜的小兽肾脏标本接种于10 ml含5-氟尿嘧啶的EMJH培养基中。将培养管置28 ℃恒温培养箱中培养，每隔7 d取培养液1 ml接种到新的EMJH培养基传代，另取0.2 ml培养液提取核酸用RT-qPCR检测并记录Ct值。若培养液的Ct值明显小于前一次培养液的Ct值，提示有钩体生长，当培养液的Ct值< 20时即为分离成功；反之继续传代培养至第60天，仍未见生长者则做阴性处理。

对阳性钩体核酸23S rRNA进行反转录PCR（reverse transcription，RT-PCR）扩增，引物序列与扩增条件参照中华人民共和国质量监督检验检疫总局行业标准（SN/T3741.1－2013）^[9]。扩增产物经1.5%琼脂糖电泳分离后，特异性条带送上海赛恒生物科技公司进行测序。获得的序列与GenBank数据库中的序列经基于局部序列比对算法的搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比对确认。钩体23S rRNA基因片段核苷酸序列同源性分析采用DNAStar中MegAlign分析，同源性 > 99.70%为同一基因种^[10]。基因亲缘关系分子进化树通过MEGA 6.0软件以邻接法构建。

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析，率的比较采用χ²检验和Fisher确切概率法，多因素分析采用logsitic回归法，P < 0.05为差异有统计学意义。

2023年1月－2023年12月，在白泉镇共布放有效鼠夹3 120夹次，捕获小兽234只，总密度为7.50%。其中啮齿目（Rodentia）鼠类135只，密度为4.33%；食虫目（Insectivora）臭鼩（Suncus murinus）99只，密度为3.17%。鼠类中褐家鼠（Rattus norvegicus）占74.07%（100/135）、小家鼠（Mus musculus）占11.11%（15/135）、黄胸鼠（R. tanezumi）占5.19%（7/135）、北社鼠（Niviventer Confucianus）占5.19%（7/135）、黄毛鼠（R. losea）占4.44%（6/135）。

234份小兽肾脏组织中钩体核酸阳性59份，总阳性率25.21%（59/234），见表 1。食虫目臭鼩阳性率19.19%（19/99），啮齿目鼠类阳性率29.63%（40/135），不同鼠种间阳性率差异无统计学意义（P=0.172），啮齿目与食虫目之间阳性率差异无统计学意义（χ²=3.257，P=0.071）。不同阳性强度中褐家鼠与臭鼩的构成比差异无统计学意义（χ²=3.319，P=0.190），褐家鼠与臭鼩的强阳性检出率差异有统计学意义（χ²=5.590，P=0.018）。

表 1 浙江省舟山市定海区白泉镇主要宿主动物钩端螺旋体核酸检出情况 Table 1 Detection of Leptospira nucleic acids in main host animals in Baiquan Town, Dinghai District, Zhoushan, Zhejiang Province

表选项

根据白泉镇的地形条件与社区/村分布情况，按照单月监测的原则在不同区域进行布点，见表 2。不同捕获月份的小兽阳性率差异无统计学意义（χ²=6.197，P=0.287），不同捕获地点（方位）的小兽阳性率差异无统计学意义（χ²=5.507，P=0.239）。采用logsitic回归将小兽种类、性别、捕获时间、捕获地点、捕获生境纳入模型分析，各因素与小兽阳性检出率相关性均无统计学意义（P > 0.05）。

表 2 浙江省舟山市定海区白泉镇不同时间和不同地点宿主动物捕获与钩端螺旋体感染情况 Table 2 Captured host animals and leptospirosis pathogen infection at different times and places in Baiquan Town, Dinghai District, Zhoushan, Zhejiang Province

表选项

对小兽肾脏钩体核酸检测阳性标本Ct < 25.0的22份标本进行钩体23S rRNA基因序列扩增、测序，19份标本测序成功。经与GenBank数据库序列比对显示，白泉镇的小兽中存在博氏（L.borgpetersenii）与问号（L.interrogans）2个钩体基因种，其中博氏基因种13份，问号基因种6份。相同基因种之间同源性为100%，不同基因种之间同源性为99.42%。聚类分析28个基因种的自举值为96%，见图 1。博氏基因种来自褐家鼠6份、臭鼩4份、黄毛鼠占2份、北社鼠1份，问号基因种来自褐家鼠5份、臭鼩1份，不同基因种对应的小兽种类构成比差异无统计学意义（P=0.635）。携带博氏基因种的小兽捕获生境中农村居民6份、农田耕地3份、城镇居民2份、重点行业2份，携带问号基因种的小兽捕获生境中农村居民区3份、城镇居民区2份、农田耕地1份，博氏与问号基因种在不同生境的差异无统计学意义（P=0.901）。

注：●参考序列（Lai strain 56601-NR_076185.1、FMAS AP8-CP072620.1）；○临床病例；ZJZS-H1血清样本；ZJZS-H2-S血清样本；ZJZS-H2-U尿液样本；▲问号基因种；△博氏基因种；ZJZS浙江舟山；ZJDH浙江定海，为本研究所获序列；ZJPT浙江普陀；R鼠肾样本；P猪尿样本；H人血或人尿样本。 图 1 浙江省舟山市定海区白泉镇钩端螺旋体基因序列系统进化分析 Figure 1 Phylogenetic analysis using the 23S rRNA gene sequences of Leptospira in Baiquan Town, Dinghai District, Zhoushan, Zhejiang Province

图选项

本研究在1只黄毛鼠的肾脏样本传至第三代的培养液中分离到1株疑似钩体菌，RT-qPCR的Ct值为15.16，普通RT-PCR检测结果23S rRNA、16S rRNA、SecY和lipl 32 4个重要基因均为强阳性，测序分析结果为博氏基因种。该菌株送浙江省疾控中心鉴定结果为钩体，暗视野镜检++，暗视野显微镜凝集试验（microscopic agglutination test，MAT）效价 > 1∶6 400，血清型为爪哇群爪哇型（56602）。

共采集白泉镇常住居民血清516份，其中男性285份，女性231份，平均年龄（63.67±5.52）岁。人群血清钩体核酸检测均为阴性，检出钩体抗体阳性34份，阳性率6.59%（34/516）。IgG抗体阳性33份，阳性率6.40%（33/516），A值分布在0.81~0.99的12份，1.00~1.99的19份，≥2.00 2份；IgM阳性12份（其中IgM、IgG双阳性11份），阳性率2.33%（12/516），A值分布在0.67~0.99的6份，1.00~1.99的6份。不同区域人群抗体阳性率：东部（柯梅村、繁强村）5.26%（2/38）、西部（小展村、星塔村、洪家村）6.67%（5/75）、南部（和平村、皋泄村、潮面村）9.70%（10/103）、北部（新港村、星马村）4.76%（4/84）、中部（金山村、白泉村、万金湖社区、米林村、河东村）6.01%（13/216），不同区域的人群抗体阳性率差异无统计学意义（P=0.637）。

我国地域广阔，自然环境差异较大，不同地区优势鼠种及鼠种构成存在一定差异，在钩体病原的研究中，多数省份的优势鼠种均为黑线姬鼠（Apodemus agrarius）^[11-13]。本研究中，白泉镇捕获小兽中褐家鼠占比最高，与全国病媒生物鼠传疾病监测报告^[14]中浙江省褐家鼠数量捕获数量最多一致。黑线姬鼠在舟山不属于优势种群，此次未捕获到黑线姬鼠与舟山其他区域鼠类生态学监测中的黑线姬鼠捕获数量较少相符^[15]。本项研究中，在白泉镇不同区域、不同时间、不同生境捕获的不同种类小兽钩体感染情况差异无统计学意义。可能是因为白泉镇地域相对局限，镇内区域划分差异较小，主要生境较为单一，致使钩体在时间、空间与种类间对属主的选择性不明显，且捕获的鼠种类中仅褐家鼠数量相对较多，小家鼠、黄胸鼠、黄毛鼠和北社鼠的数量均较少，数量较少的样本代表性较差。下一步研究中可考虑扩大监测范围，将舟山市内其他区域纳入监测后进行比对分析。

本研究中白泉镇小兽的钩体核酸总阳性率为25.21%，高于贵州省遵义市的7.87%^[16]、浙江省台州市的10.78%^[17]、江苏省南通市的17.95%^[18]、全国各省鼠类钩体总感染率5.75% ^[14]，低于舟山市普陀区展茅街道的30.00%^[2]与福州地区的38.60%^[19]，提示白泉镇钩体宿主动物感染率明显高于全国的平均水平，与近来舟山市年年有临床病人发生情况相吻合。本次捕获的小兽中臭鼩占42.31%，臭鼩中钩体核酸检出率19.19%，高于2021年全国食虫目鼩鼱科3.65%的检出率^[14]，提示臭鼩作为钩体的宿主在钩体病的防控中也应得到重视。小兽在人类栖息地附近无处不在，是钩体病主要宿主动物和传染源，多呈隐性感染，自身不发病，却会排出大量病原体污染环境，传染人和其他易感动物^[11]。通常情况下小兽肾脏中钩体菌浓度越高其尿液中的钩体菌含量也越多，对人与环境危害也越大。RT-qPCR试验中Ct值越小样本中靶基因拷贝数量越多，通过Ct值大小可大致判定宿主动物所携带的钩体菌数量，因此今后在评估当地钩体流行风险时可考虑关注携带高浓度钩体菌的小兽比例。23S rRNA基因片段常用于钩端螺旋体基因种分种，白泉镇鼠类中钩端螺旋体主要为博氏与问号2个基因种，与本市普陀区小兽和患者中的钩体基因种构成相同且基因序列高度同源，提示博氏与问号基因种可能是白泉镇乃至舟山本岛钩体病流行的主要致病基因种。

本研究中白泉镇常住居民年龄结构偏大，究其原因主要是城市化建设发展需要，乡镇农村居民逐渐减少，留守老人已成为农村居民的主力，且多数存在长期野外农耕等作业经历，此类人群将成为钩体病流行中最为主要的易感人群。舟山地区多年未有钩体病疫情流行，未实施钩体疫苗的接种。白泉镇常住居民血清中钩体抗体自然感染率为6.59%，低于毗邻有病例的展茅街道居民血清钩体抗体11.59%的阳性率^[2]，与浙江省缙云县的28.71%^[20]、广东省清远市的24.32%^[21]、云南省丽江市的19.67%^[22]、福建省武平县的43.89%^[23]阳性率相比属于低水平感染状态，但也提示该区域常住居民存在钩体感染及钩体免疫水平较低的情况，而舟山地区钩体病例鲜有报告^[24]，可能与隐性感染以及轻症病例的漏诊、误诊有关。目前人群血清中钩体抗体在ELISA定量检测结果与MAT结果的相关性报道甚少，有待进一步研究。

钩体病流行有4个主要因素：鼠密度、带菌鼠种带菌率、人群自然抗体水平及8月份降雨量^[25]。本研究舟山市白泉镇小兽密度为7.50%、鼠密度为4.33%，鼠带菌率29.63%、臭鼩带菌率19.19%，人群自然感染抗体阳性率6.59%，且8月常有台风侵袭而导致降雨量大，人群免疫率低，存在再次出现病例的可能乃至发生流行的风险。建议当地加强爱国卫生运动，开展灭鼠防鼠工作，降低小兽密度；同时广泛开展健康宣传活动，提高野外作业人员的防护意识；加强对钩体病例主动监测，提高医疗机构对钩体病的鉴别诊断能力，及早发现、及早诊治、及早报告。

利益冲突  无